实验2大蒜SOD.docVIP

大蒜中超氧化物歧化酶的提取及其酶活力测定 一、实验目的： ⒈　掌握SOD酶的提取、分离、检测一般步骤。 ⒉　了解酶在提取过程中的两个参数：回收率、纯化倍数。 ⒊　掌握离心机的使用。二、实验原理： 邻苯三酚在碱性条件下可迅速自氧化,释放出O2-,生成带色的中间产物,在420nm有最大吸收峰。邻苯三酚自氧化产生的中间产物在40s-3min这段时间，生成物与时间有较好的线性关系。 颜色深→SOD逐渐增多→颜色浅，即酶活力越大，颜色越浅。三、实验材料及试剂： 大蒜、磷酸缓冲液（PH7.8, 0.05mol/l）、氯仿—乙醇混合液、冷丙酮、邻苯三酚）、浓盐酸四、操作步骤：1、SOD提取：称取5g大蒜蒜瓣,加入石英砂研磨破碎细胞，加入15ml的PH7.8? 0.05mol/L的磷酸缓冲液，研磨搅拌20分钟，使SOD充分溶解，6000rpm离心，弃去沉淀，得上清液。(留出1ml备用,准确量取剩余上清液体积,记录) 2、除杂蛋白 ：提取液加入1/4体积的氯仿－乙醇混合液搅拌10分钟，6000rpm离心15min去沉淀，得粗酶液。（取1ml粗酶液备用,精确测量剩余粗酶液体积） 3、SOD酶的沉淀分离：剩余的粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，6000rpm离心15min，得到SOD酶沉淀。将沉淀每管先加2ml磷酸缓冲液，溶解后在加3ml混匀。6000rpm离心15min，取上清得到SOD酶液。取1ml备用，其余量取体积。 4、粗酶液活性测定（邻苯三酚法） 提取液、粗酶液、酶液中SOD活力检测，具体步骤如下。 试剂/ml 空白管 对照管OD1 提取液 粗酶液 酶液 PH缓冲液 3 3 3 3 3 SOD提取液 0 0 0.1 0.1 0.1 蒸馏水 2 1.8 1.7 1.7 1.7 室温放置20min ? 邻苯三酚0 0.2 0.2 0.2 0.2 加入邻苯三酚后迅速混匀,准确计时4min,加一滴浓盐酸 停止反应,420nm测吸光值. 5、溶液中可溶性蛋白含量测定： 分别从1ml 备用的提取液、粗酶液、酶液各取0.3ml按以下倍数稀释,260nm/280nm测定吸光值,按公式计算蛋白质浓度. 提取液稀释:50 × 粗酶液稀释:20 × 酶液稀释:10 × 蛋白质浓度(mg/ml)=(1.45A280 – 0.74A260) ×稀释倍数 6、计算： 酶活力单位U/ml=2（OD1-OD2）×5/0.1 (1ml反应液中,每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达到80%时的酶量) 总活力U=活力单位×总体积 比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度 纯化倍数=粗酶液(酶液)比活力/提取液比活力 回收率=粗酶液(酶液)总活力/提取液总活力五、实验数据记录及结果计算：1、提取液、粗酶液、酶液体积记录(除去留下的1ml) ? 提取液 粗酶液 酶液 体积（ml） 13.4 13.2 8.9 2、420nm吸光值测定： ? 空白管 对照管OD1 提取液 粗酶液 酶液 吸光值 0.000 0.004 0.014 0.022 0.027 3、稀释后的SOD提取液280nm\260nm吸光值： ? 提取液50 × 粗酶液20 × 酶液10 × 280nm吸光值 0.055 0.098 0.030 260nm吸光值 0.082 0.144 0.040 4、按公式计算蛋白质浓度： 稀释提取液中蛋白质浓度：（1.45×0.055－0.74×0.082）×50=0.9535mg/ml 稀释粗酶液中蛋白质浓度：（1.45×0.098－0.74×0.144）×20=0.7108mg/ml 稀释酶液中蛋白质浓度：（1.45×0.030－0.74×0.040）×10=4.054mg/ml5、酶活力单位、总活力、比活力计算： ? 提取液 粗酶液 酶液 酶活力单位U/ml 2（OD1-OD2）×5/0.1 -1 -1.8 -2.3 总活力U= 活力单位×总体积 -14.4 -25.56 -22.77 比活力U/mg= 活力单位/蛋白质浓度 -15.1023 -35.9595 -5.6167 回收率 6、粗酶液： 纯化倍数=粗酶液比活力/提取液比活力=35.9595/15.1023=2.3811 回收率=粗酶液总活力/提取液总活力=25.56/14.4×100%=177.5% 酶液： 纯化倍数=酶液比活力/提取液比活力=5.6167/15.1023=0.3719 回收率=酶液总活力/提取液总活力=22.77/14.4×100%=158.1%