DNA复制-修复和重组.pptVIP

第二章 DNA的复制，修复和重组 1. DNA的代谢过程包括复制，修复和重组 2. 大肠杆菌遗传图 整个图分为100分钟，每分钟约40，000bp。基因名称基本反映基因的功能，用3个斜体字母表示，如mut，诱变相关基因；pol，DNA多聚酶基因；rec，重组相关基因等等。 作为基因产物的蛋白质名称则用第一个字母为大写的正体字，如“RecA 蛋白”。 第一节 DNA复制 一. 关于模板的概念（template） 模板分子的概念产生于DNA双螺旋结构建立之前，能指导子代生物大分子按特定顺序合成的母链称模板。 二. DNA复制的基本规律 a. DNA复制是半保留的； b. DNA复制在一个原点（orgin）开始，双向进行；DNA分子复制的起点称原点，大肠杆菌的复制原点称OriC，终点区是ter。DNA复制点呈分叉状，分叉状复制区域称复制叉。 c. DNA复制是半不连续的； I. 冈崎片断（Okazaki fragments）； II. 复制叉上的前导链（leading strand）和滞后链（lagging strand）； 三. 依赖于DNA的DNA聚合酶 1. E.coli DNA polymerase I 的发现，Arthur Kornberg，1955，单肽链，Mr＝103,000。 2. DNA聚合酶酶促反应机制 (dNMP)n+d NTP (dNMP)n+1+PPi 引物 任意脱核 延长一个 焦磷酸 苷三磷酸 核苷酸残基 DNA聚合反应的关键是生长链的末端核苷酸的游离3’羟基对下一个参加聚合 反应的脱氧核苷三磷酸中的α-磷原子发动亲核进攻，建立酯键，释放出焦磷酸。 DNA聚合酶催化反应的基本规律： 所有DNA聚合酶都需要模板； 所有DNA聚合酶都需要引物（primer）；引物：互补于模板链的一个寡核苷酸片断，它带有一个游离的3’－OH，以便建立新的磷酸二酯键。 所有的核酸链聚合反应都从5‘——3’方向进行。 四. DNA多聚化的热力学 DNA聚合酶 (dNMP)n+d NTP (dNMP)n+1+Ppi ppi 焦磷酸酶 2pi ＋2 KJ/mol －30 KJ/mol －28 KJ/mol ΔG0’＝-28 KJ/mol 但由DNA聚合酶催化的上述反应在无焦磷酸酶参与下仍能继续进行。聚合反应导致多重弱相互作用的形成，它们释放的能量促进多聚化反应： C－H 约100 KJ/mol；OH …O＝C 约4-5 KJ/mol；van der Waal’s 约1 KJ/mol。 五. DNA聚合酶催化DNA聚合反应的精确性 E.coli 中的实际错误率 10-9－10-10； E.coli 基因组4.7× 106bp； 1. 复制的碱基配对可以达到10-4－10-5的错误率。这错误率相当于碱基上功能基团的互变异构反应的动力学常数。 2. DNA多聚酶3‘－5’外切酶活性对碱基配对的校对作用（proof reading），可以提高精度102－103倍，距离细胞内DNA复制精度还差102。校对作用不是合成的逆反应，两种活性是独立的。 以上两个过程复制和校对，都依赖碱基配对中的非共价相互作用，这是提高信息分子复制高保真度的根本方法。 六. 大肠杆菌有多种DNA聚合酶 1. DNA polymerase I 的特性 5’－3’聚合酶活性；3’－5’外切酶活性； 5’－3’外切酶活性。 DNA合成速度不及复制叉移动速度的1/20，16-20 nt/s； 连续性太低； 遗传学证据证明pol A－细胞也能存活； 2. II 型DNA聚合酶和III 型DNA聚合酶 II 型参加SOS修复； III 型是主要的DNA复制酶； 3. E.coli I 型DNA聚合酶的两个主要应用 a.“Nick translation”（切口移位技术），I型DNA聚合酶具有以双链DNA的一个切口开始，用5‘－3’的外切酶活性降解这条旧链，并合成一条新链代替旧链，用这种技术在试管内把放射性核苷酸导入DNA，用于探针放射性的标记。 b.多聚酶链式反应（PCR，polymerase chain reaction），在试管内扩增一个特定基因组片断的一个方法。 4. E.coli 三种D