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Western Blot 封闭 封闭是为了使我们的抗体仅仅只能跟特异的蛋白质结合而不是和膜结合。 常用的封闭液有bovine serum albumin(BSA)，non-fat milk ，casein，gelatin，tween-20 等，我们 一般用non-fat milk 。 在转移结束前配好5%的Milk(TBST 溶解)。转移结束后将膜放入milk 中block(一定要放在干净的容 器里，避免污染而且要足以覆盖膜)，并清洗整理好用过的滤纸，以便下次使用。 Block 4°C O/N，或 R T 1 小时。 封闭后可以不洗膜，让膜的一角在吸水纸上接触，把封闭液控一下即可。 如何选择实验抗体（一抗的选择原理及方法）？ 检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供选择，在同一个抗体公司，可能会有好几种，甚至好几 十种；在不同的抗体公司，那就更多了。那怎样在琳琅满目的抗体中，选择自己实验需要的抗体呢？主要 考虑如下几种因素：分析自己实验应用的实验方法是哪种？分析自己实验中标本的种属是哪种动物或人 的？分析样本中的蛋白质的结构性质，分析抗体的标记和检测，分析抗体的宿主来源种属等等。 1.分析自己实验应用的实验方法是哪种？ 一般抗体说明书都列出该抗体经试验验证过适用于何种分析类型，如：可以应用于WB、IHC、ICC、 ELISA、FCM 分析等。 如果抗体说明书没有提及的应用类型，并不意味着该抗体不适用于此种分析应用类型，而仅是说明 尚未经过此种分析试验验证。为了避免实验风险，当说明书中没有提及的应用方法时，可向商家申请测试 装，进行测试后，再决定是否购买（试用装申请入口：/try/ ）。 如果抗体不适用某些分析试验，则会在抗体说明书上标注出来不适于某分析试验。 2.分析自己实验中标本的种属是哪种动物或人的？ 一般抗体说明书都列出该抗体经试验验证过适用于何种动物或人的标本，如：可以用于rat、mouse、 human、pig、goat 等动物的标本的实验。也就是说应选择物种相同或有交叉反应的抗体，抗体可能与不同 物种的同种靶蛋白有交叉反应，因其氨基酸序列同源性较高。 如果样本的种类未列入抗体说明书上的交叉反应种属表中，并不意味着该抗体不适用于检测该物种 的蛋白，而只是表示该物种尚未用此抗体检测验证过。为了避免实验风险，尽量不要使用说明书中没有提 及的标本的种属的抗体。 或者通过序列比对的方法来预测交叉反应，可应用Expasy 和NCBI BLAST 来进行不同物种蛋白同 源性比对。如果比对结果，证明同源性比较高的，也可以选择。 3.分析样本中的蛋白质的结构性质 了解样本蛋白的结构性质有助于选择最合适的抗体，至少两方面因素需要考虑 待测样本蛋白的结构域：抗体是由各种不同免疫原免疫宿主而制备得来，其中的免疫原包括：全长 蛋白、蛋白片断、多肽、全有机体（如：细菌）或细胞，抗体说明书一般都有免疫原的描述，如果打算检 测的是蛋白片断或一种特殊的同型物或蛋白全长的某一区域，则必须选择用含此片段域的免疫原制备出的 抗体。如果打算用FCM 流式检测活细胞的表面蛋白，则需要选择含该表面蛋白的胞外域来免疫制备的抗 体。 样本的提取或处理过程：某些抗体要求样本经过某些特殊处理，例如：许多抗体只识别还原和变性 的、表位已暴露不受二级四级结构阻碍的蛋白样本，另一方面，某些抗体仅识别天然折叠状态的蛋白。当 选择免疫组化的抗体时，应注意某些抗体只识别未固定的冷冻的组织，而另一些抗体则适用于无需抗原修 复解交联步聚的甲醛固定石蜡包埋的组织，这些都会在抗体说明书上应用部分标示出来。 4.抗体宿主物种的选择 一般说来，在使用偶联二抗结合无偶联物的一抗时，一抗宿主动物的物种选择较为重要，对于免疫 组化而言，尽可能选择与样本不同种系物种的一抗，从而避免二抗与样本内源性免疫球蛋白产生交叉反应， 例如：检测小鼠样本蛋白，则不应选择小鼠或大鼠源的一抗，最好选兔源的一抗，则二抗则可选择偶联了 检测分子（酶、荧光素、生物素等）的抗兔IgG。如果选择有偶联物的一抗则不适用上述情况，除免疫组 化外的其它对不含内源性免疫球蛋白样本的检测方法，则抗体宿主物种的影响不大，如对不含IgG 的细胞 裂解物样本的western blotting 检测，尽管如此，含有血清的组织裂解物和组织培养上清中含有免疫球蛋 白，还原变性样本中含IgG