[农学]核酸分子杂交技术-2.pptVIP

概念：用同位素或其他化学方法标记的与待测靶核苷酸序列互补杂交的核酸片段（DNA或RNA ）。 用途：检测待检核酸样品中的特定基因序列。 (DNA-DNA; DNA-RNA; RNA-RNA) 要求：特异性，来源方便 hybridization DNA:DNA 5’ A T G C C G A T 3’ T A C G G C DNA:RNA 5’ A T G C G T A 3’ U A C G C A U RNA:RNA 5’ A U G C U A C G 3’ U A C G A U G C 特点 :◆ 灵敏度高，特异性高； ◆ 检出限：1~10ug ； ◆ 环境污染，半衰期短。 三 核酸分子杂交技术 Southern印迹杂交 Southern杂交的应用 检测某一基因的大小、拷贝数、酶切图谱和它在染色体中的位置； 检测基因点突变 三、基因表达产物的检测Western印迹法 蛋白质水平上的杂交技术，又称为免疫印迹，即检测蛋白质与标记的特定蛋白抗体结合，经放射自显影显示条带，根据条带密度确定蛋白质表达量。 优点: 分辨率高(1~5ng);特异;简便;稳定 质粒(plasmid) 能在宿主细胞中利用宿主酶自主复制的小的核酸分子，存在于大多数细菌和某些真核细胞染色体外的胞质中。 质粒DNA的三种构型 三 核酸分子杂交技术 4）原 位 杂 交(in situ hybridization，ISH) 使探针进入细胞内与待测的核酸进行特异性结合形成杂交体，从而对待测核酸进行细胞内定位的方法。 ? 确定与探针互补的核酸序列在细胞内的 空间位置 原位杂交原理示意图 菌落杂交(colony hybridization ) 5）生物芯片 一、生物芯片(biochip)的概念 指通过机器人自动印迹或光引导化学合成技术在硅片、玻璃、凝胶或尼龙膜上制造的生物分子微阵列，以实现对细胞、蛋白质、基因及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。 主要特点：高通量、微型化和自动化。 基因芯片技术(gene chip): 将大量探针分子固定于支持物上，根据碱基互补配对原理，与标记的样品分子进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布进行基因分析。 第四节 反义核酸及药物 反义核酸（antisense nucleic acid） 反义核酸的分类（按作用机制） ? Ⅰ类反义核酸 直接作用于靶mRNA的核糖体结合位点（如SD序列）和(或)部分编码区，直接抑制翻译，或与靶mRNA结合形成双链RNA，从而易被RNA酶Ⅲ降解； ? Ⅱ类反义核酸 与mRNA的编码区结合，引起其构象变化，抑制翻译； ? Ⅲ类反义核酸 直接抑制靶mRNA的转录及转运（胞核中起作用）。 三代反义核酸药物 　 反义DNA（antisense DNA） 反义RNA （antisense RNA） 肽核酸（peptide nucleic acid，PNA） 　 ? 特异高效：只阻断特异基因的表达; ?安全无毒：只与特定mRNA结合，不改变基因结构，最终会被RNase水解; ? 操作简单：可大量合成，方便快捷; 　 ? 靶基因范围广：适应于多种疾病，亦可同时用多个反义核酸封闭多个基因， 有可能应用于多基因病治疗; ? 设计最优化：本质上是应用基因的天然顺序信息，是最合理的药物设计。 （ RNA interference） 共抑制与基因沉默 1990 年,为加深矮牵牛花( petunias) 的紫色,Jorgensen 等导入了一个色素基因。结果许多花瓣颜色并未加深,反而呈杂色甚至白色。这是由于转入的基因和同源的内源基因的表达都被抑制了，Jorgensen 把这个现象命名为共抑制(cosuppression) 。 RNAi的发现 1995年，Guo S等试图阻断秀丽新小杆线虫（C. elegans）中的par-1基因的表达。 设计： 反义RNA 特异性地阻断par-1基因的表达； 正义RNA 以期观察到基因表达的增强。 结果: 二者都同样地切断了par-1基因的表达途径。