shRNA详细设计教程以pLKO.docx

shRNA设计此教程用于不知道siRNA靶点的设计，从文献中选择序列，可以从第5步开始设计1.选择基因例如 Gene Name:TP53Accession:NM_000546.52. 寻找靶点/rnaiexpress/setOption.do?designOption=shrnapid=-7168952604080645646输入基因序列号，或者粘贴序列点击 RNAi设计3.靶点选择（选择星号比较多的2-3个作为目的序列）4.shRNA网页设计点击设计shRNA OLigos网页上的loop 可以不更改（后面需要更改为常用loop序列TTCAAGAGA）点击设计设计好的序列如下（上面是以thermo的载体(pENTR?/U6)设计）5.后续的根据自己的载体手工设计shRNA（以PLKO.1-puro设计，酶切位点AgeI EcoRI,酶切位点后1300bp有一个单一的酶切位点KpnI）注意：shRNA比较短，而且结构复杂，测序困难，选择载体上的单一酶切位点，设计到shRNA里面，用于后续的单酶切验证设计模板按照下图(下图去除AgeI和EcoRI,也可以适当位置添两个碱基保留着两个酶切位点)5’-CCGG siRNA正向序列TTCAAGAGA反向互补序列TTTTTTGGTACC-3’3’- 正向互补序列 AAGTTCTCT 反向序列 AAAAAA CCATGG TTAA-5’将网页上设计的shRNA 序列替换到上述模板替换之后如下5’-CCGGGCTTCTTGCATTCTGGGACAGTTCAAGAGACTGTCCCAGAATGCAAGAAGCTTTTTT GGTACC-3’3’- CGAAGAACGTAAGACCCTGTCAAGTTCTCTGACAGGGTCTTACGTTCTTCGAAAAAA CCATGG TTAA-5’注意：正义链为5’→3’，反义链为3’ →5’，合成时需要进行反向处理。6.验证设计的shRNA是否合适二级结构（用DNAMAN分析二级结构）分析正反向引物是否匹配用Snapgene 分析，正向序列输入进去，反向的作为引物用来验证（注意5’ 3’方向）一个正确的shRNA应该入下图7.最终发送合成的序列为5’-CCGGGCTTCTTGCATTCTGGGACAGTTCAAGAGACTGTCCCAGAATGCAAGAAGCTTTTTT GGTACC-3’5’-AATTGGTACCAAAAAAGCTTCTTGCATTCTGGGACAGTCTCTTGAACTGTCCCAGAATGCAAGAAGC-3’8.引物合成shRNA对引物纯度要求不高，不需要用page纯化，为了节约成本，用低一级的纯化方式HAP即可使用。9.引物退火连接稀释到50uM取各取4.5ul，加1ul，退火buffer（可以用不含dNTP和酶的PCRbuffer），95℃ 3min，自然降温到室温。将载体酶切尽可能保证载体全部双酶切切开，可以选择NEB没有星活性的的酶。取1ul 退火后的溶液，与载体（20-50ng就够了）连接并转化。10.质粒提取并验证如果有载体自连对照为阴性，可以取两个单克隆提质粒KpnI单酶切，如果有能切出一个1300bp左右的片段，可以认为构建是正确的。取一个质粒进行测序，测序的时候告知测序公司，此质粒为发卡结构，和poly结构。附录1. shRNA启动子多数的siRNA表达载体依赖RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种,操纵一段45—50nt的发夹结构RNA（small hairpin RNA,shRNA）在哺乳动物细胞中的表达,shRNA在细胞内会自动被加工成为siRNA,从而引发基因沉默或者表达抑制.这一类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子等。采用RNA pol III启动子的原因是由于它有明确的启始和终止序列,总是在离启动子一个固定距离的位置开始转录合成RNA,遇到4—5个连续的U即终止,并且转录产物在第二个尿嘧啶处被切下来,非常精确,而且还可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA.转录出的RNA形成发卡样结构后,会在3’端形成2个突出的尿嘧啶,这类似于天然的siRNA,因而有利于双链RNA诱发RNAi。要使用这类载体,需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链,退火后克隆到相应载体的pol III 启动子下游。克隆的过程需要几天的时间,也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。先在体外构建能表达双链RNA的载体,再将载体转移到细胞内在细胞内合成出双链RNA,不但能增加有效转染细胞的种类,而且在长期稳定表达载体的细胞株中,双链RNA能够长期发挥阻断基因的作用。现在有多个报道说通过质粒表达siRNAs同样可以抑制特定基因的表达.当这种带有PolIII 启动子和