药代动力学高效液相色谱法测定家兔血浆中对乙酰氨基酚的药物浓度.PDFVIP

药代动力学 高效液相色谱法测定家兔血浆中 对乙酰氨基酚的药物浓度方法的建立 一、 试验目的 1. 掌握高效液相色谱仪的操作方法。 2. 熟悉体内药物分析方法的建立过程。 3. 了解生物样品处理的方法。 二、 试验原理 1. 高效液相色谱系统 （HPLC 系统）简介 HPLC 系统一般由输液泵 、进样器 、色谱柱、检测器 、数据记录及处理装置等 组成 。其中输液泵 、色谱柱 、检测器是关键部件 。有的仪器还有梯度洗脱装置 、 在线脱气机 、 自动进样器、预柱或保护柱 、柱温控制器等，现代 HPLC 仪还有微 机控制系统 ，进行自动化仪器控制和数据处理 。制备型 HPLC 仪还备有自动馏分 收集装置 。最早的液相色谱仪由粗糙的高压泵 、低效的柱 、固定波长的检测器、 绘图仪 ，绘出的峰是通过手工测量计算峰面积 。后来的高压泵精度很高并可编程 进行梯度洗脱 ，柱填料从单一品种发展至几百种类型 ，检测器从单波长至可变波 长检测器、可得三维色谱图的二极管阵列检测器、可确证物质结构的质谱检测器 。 数据处理不再用绘图仪 ，逐渐取而代之的是最简单的积分仪 、计算机 、工作站及 网络处理系统。 HPLC 有以下特点 ：高压，高速 （流速为 0.1~10.0 ml/min ），高效，高灵敏 度 （紫外检测器灵敏度可达 0.01ng ），消耗样品少 。HPLC 与经典液相色谱相比有 以下优点：速度快 （通常分析一个样品在 15~30 min，有些样品甚至在 5 min 内即 可完成 ），分辨率高— 可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果 ，灵敏度高 （紫 外检测器可达 0.01ng ，荧光和电化学检测器可达 0.1pg ），柱子可反复使用 （用一 根色谱柱可分离不同的化合物 ），样品量少 ，容易回收— 样品经过色谱柱后不被破 坏 ，可以收集单一组分或做制备 。 进行 HPLC 检测通常要先行确定色谱条件，即色谱柱，流动相，流速，检测波长，检 测柱温及检测灵敏度。建立方法时 ，应考虑下列事项 ：①首选填料为十八烷基键合硅 胶 ，并至少对两根不同品牌的色谱柱进行比较试验 ，其中一根为国产柱 。②流动相 首选甲醇-水系统 ，应尽可能少用含有缓冲液的流动相 ，如为碱性药物 ，流动相的 pH 值应为 7~8 ；如为酸性药物 ，流动相的 pH 值应为 3~4 。③尽可能选用流动相作 为溶剂 ，如未能选用 ，应说明原因 。④内标物应首选易得到的纯度较高的化学试剂 或对照品 ，应与待测物质化学结构相似 ，理化性质接近 ，峰的响应值相当 ，以及 分离度应大于 1.5，另应考虑对照品的来源问题 。⑤检测器首选 UV 检测器 。 2. 体内药物分析概述 体内药物分析任务和对象的特点：1、被测定的药物和代谢物的浓度或活性极低；2 、样 品中存在各种直接或间接影响测定结果的物质，大多需要分离和净化；3、样品量少，尤其 是连续测定时，很难再度获得完全相同的样品；4 、工作量较大，随着工作的深入开展，会 成倍地甚或按指数级数增加；5、往往要求很快地提供结果，尤其在毒物检测工作中；6、实 验室应有多种检测手段，可进行多项分析工作；7、测定数据的处理和阐明有时不太容易。 样品的种类、采集和储存： 1) 样品的种类和选取原则： ① 血样：血浆(plasma)和血清(serum)是体内药物分析最常采用的样本，其中选用 最多的是血浆。因血浆中的药浓可反映药物在体内 （靶器管）的状况。而且血浆中药物 浓度的数据报道较多，可供借鉴。血浆是全血(whole blood)在加肝素、枸橼酸、草酸盐 等抗凝剂的全血经离心后分取，量约为全血的一半。血清则是在血液中纤维蛋白元等影 响下，引起析出血块，离心取得。血块凝结时往往易造成药物吸附损失。全血也应加入 抗凝剂