大蒜sod的提取分离和纯化.docVIP

一、实习时间：２０１１.１２.２８ 二、实习地点：生科实验室４０８ 三．实验题目：大蒜中SOD提取及分离纯化 １.实验目的： （１）学习并掌握大蒜SOD提取与纯化的方法及原理。 （２）学习并掌握邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活的方法。 （３）熟悉考马斯亮蓝测定蛋白含量的实验原理和方法。 ２.实验原理： 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD5)广泛存在于动植物及微生物体内，可催化细胞内超氧负离子( O2-) 的歧化反应，使 O2-转化为 H2O2 和 O2。因此，SOD是一种具有抗脂质氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶及功能性酶，在医药、食品、化妆品等领域有着广阔的应用前景。 SOD是一种亲水性的酸性酶蛋白，在酶分子上共价连结金属辅基，按照其结合的金属离子，主要可分为Fe-SOD、Mn-SOD和Cu/Zn-SOD 3种。Cu/Zn-SOD是分布最广而且是最重要的SOD，主要存在于真核细胞的细胞浆内，分子量约为32KD，一般由两个亚基组成。SOD对热、pH以及某些理化性质有很强的稳定性，即使温度达到60℃，经短时处理酶活几乎无损失；同时，酶活性不受乙醇和氯仿影响，但Cu/Zn-SOD对氰化物及过氧化氢均敏感。SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。Cu/Zn-SOD由于色氨酸含量低，其最大紫外吸收为258nm，由于含铜，所以在可见光680nm处有最大吸收。 国内测定SOD活力一般采用邻苯三酚自氧化法或改良的邻苯三酚自氧化法。在碱性条件下，邻苯三酚会迅速自养化生成有色中间产物，同时生成超氧负离子（O2-）。中间产物在325 nm 和420nm 波长处均有强烈的光吸收。邻苯三酚的自氧化速率与O2-的浓度有关。当有SOD存在时，由于它可催化超氧负离子(O2-) 的歧化反应，生成氧和过氧化氢：，从而抑制邻苯三酚的自氧化，阻止了中间产物的积累。因此，可通过监测 SOD 对这个反应的抑制程度间接测定 SOD 活力。大蒜中的SOD正属于Cu/Zn-SOD。 ３.实验材料 实验材料：大蒜 ４.实验操作步骤 Ａ[试剂和器材]： 　材料：　市售新鲜大蒜. 　仪器　：恒温水浴 、离心机、 布氏漏斗、抽滤瓶 烧杯、量筒、搅棒、 透析袋 、搅拌机 　试剂：　-18℃预冷的丙酮、磷酸缓冲液（pH7.8, 0.05mol/L） Ｂ[方法和步骤] （１）将蒜瓣去外膜,于搅拌机中搅拌10min后移至研钵中研磨至蒜泥状 （２）SOD粗提取方法 提取25g大蒜去皮后加入5ml磷酸缓冲液，浓度20mmol/L,PH,7~8含1000mol/lEDTA，研磨破碎细胞。将其转入烧杯中加15ml磷酸缓冲液冲洗研钵比转入小烧杯中。在200~400W功率超声波破碎仪中破碎5min，转入三角瓶震荡洗净10ｍｉｎ，４层纱布过滤，滤液转入１０ｍｌ离心管中，４０００ｒ／ｍｉｎ，离心１０ｍｉｎ，收集上清，量取体积，即ＳＯＤ粗提液。 （3）SOD纯化沉淀分离方法 取粗提液于５０摄氏度水浴５ｍｉｎ，用２０ｍｏｌ／ＬＨＣＩ调至ＰＨ５.０，转入离心管４０００ｒ／ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清，量体积，测酶活及蛋百含量。加入０．６倍体积冷丙酮，充分摇匀，４０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｒ／ｍｉｎ去除杂质，蛋白沉淀，取上清量体积，测酶活性及蛋白含量，上清液中加入０．６倍体积冷丙酮，搅拌摇匀，４０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ分钟，去上清，收集沉淀，即为纯化ＳＯＤ，加入１０ｍｌ磷酸缓冲液溶解沉淀，测酶活性及蛋白含量。 ５．样品蛋白测定 　　去１ｍｌＳＯＤ液，加入考马斯亮蓝Ｇ５０， ４ｍｌ，混合均匀，２５摄氏度保温１０ｍｉｎ，５９５ｎｍ比色，求蛋白含量。 ６.SOD活性测定（邻苯三酚法） [原理]: 在碱性条件下，邻苯三酚发生自氧化反应，并产生02-，在SOD存在下，自氧化反应受到抑制。 [试剂和器材] （1）试剂 50mmol/L pH=8.3的磷酸缓冲液 10mmol/L 的EDTA 邻苯三酚 10mmol/L HCl （2）器材 试管 水浴锅 分光光度计 邻苯三酚自氧化速率为 325 nm, 0.070D /min左右 ,以 1 mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚的速率达到 50%的酶量作为一个酶活力单位 (U)。 7．【实验结果】 根据提取液、粗酶液和酶液的酶活力和体积，计算纯化提取率。 四．实习感悟 　　 1.实验中所提取到的提取液、粗酶液、酶液在未使用前最好将其先放在冰箱内，因为在低温下能降低酶的活性，防止酶活损失，如果一直放在室内会导致酶活损失，使所计算得到的酶活偏低。 ２、酶液提取时，为了尽可能保持酶的活性，尽可能在