克隆心之一套帮助新手快速作出克隆的Protocol.PDF

克隆心之一套帮助新手快速作出克隆的Protocol 本方法的是在医科院基础所的生化脂蛋白组其基础上进行了一些改动，主要是 DNA 回 收上采取了更简单的方法。本方法最适用于双酶切制作片断并进行克隆的情况。对于分步酶 切制作片断，也可以使用本方法，但需要加倍起始酶切DNA 的量。 一、片断平移的克隆（也适用于多片断连接） 简介：将用作载体的质粒A （制作大片断）酶切3μL ，要切出小片断的质粒B 酶切7μL ； 琼脂糖回收胶电泳；切胶回收来自质粒A 的大片段，和来自B 的小片断，并回收到一管中； 酚氯仿法回收DNA，酒精沉淀，干燥；加入8μL 水、1μLligase Buffer、1μL ligase ，4 ℃过夜； 次日转化涂板。 酶切 1. 配置可酶切共10μL 质粒的酶切反应体系（双酶切）： （提示在克隆设计时尽量使用好切的内切酶通常是效价高、便宜量大的酶，且注意这两 个酶有比较兼容的 Buffer，即在这种公用Buffer 中，两酶的效力变化不大至少保持 60%的 活性 。酶切体系根据需要，可加入BSA。） 酶切体系 A 质粒酶切－制作载体片断 公用Buffer 3μL 酶 I 1μL 酶 II 1μL 质粒 3μL 双蒸水 22μL 合计 30μL B 质粒酶切－制作插入片断 公用Buffer 7μL 酶 I 2μL 酶 II 2μL 质粒 7μL 双蒸水 52μL 合计 70μL 混匀。37℃，酶切3 小时。 （提示关于酶量的问题。通常的内切酶效价在 10U/μL 左右，3μL 内切酶相当于30U， 足够切10μL 的质粒。因为通常小提质粒的浓度在200－600ng/μL，一般浓度达不到1μg/μL。 根据1U 酶切1μg 质粒的原则，这一酶量是足够的。） 1%琼脂糖回收胶回收（碎胶、酚氯仿抽提法） 1. 酶切产物加入10％量的上样Buffer，混匀。使用1%的琼脂糖回收胶，电泳回收酶切产物。 2. 用手术刀切下所需要的大片断（载体）和小片断（插入片断），收入一个1.5mL 离心管中。 （提示切胶前，需用分别含酒精、NaOH 和双蒸水的纸巾擦拭凝胶接触的台面，以防污染。 手术刀要火焰消毒，而后切胶回收。） 3. 12000rpm 1 分钟，将凝胶甩到管底。 -20℃ 冰冻20 分钟。 4. 取200μL Tip 头两只，在酒精灯上稍烤化Tip 头尖端，两Tip 头尖相对来回相接触，在Tip 头顶部制成直径3mm 左右的平头，准备用于碎胶。 5. 从-20℃取出冻结的凝胶，立即使用 200μL 枪套上平头 Tip 头，捣碎凝胶。（提示 200μL 的枪足够粗壮，不要用100μL 的枪，小心折断！！！ 乘凝胶比较硬时就开始碎胶，轻而频率 高地捣碎凝胶） 6. 凝胶管中加入500μL 双蒸水，盖紧，振摇200 下。 7. 加入500μL Tris 饱和纯酚，盖紧，振摇200 下。 12000rpm 4℃ 离心15 分钟。 8. 在一新1.5mL 离心管中加入 500μL 氯仿：异戊醇（24：1），将步骤7 的上清加入本步骤 离心管中。盖紧，振摇200 下。 12000rpm 4℃ 离心5 分钟。 9. 在一新1.5mL 离心管中加入 900μL 预冷 无水乙醇、20μL 3M 的醋酸钠。将步骤8 的上 清小心加入本步骤离心管中。颠倒数次混匀。12000rpm 4℃ 离心15 分钟。（提示 吸取步骤 8 中的上清时，千万不要将有机相吸入，宁可放弃一些上清，否则影响后面的连接反应。另 外，本方法使用的醋酸钠量较小，但足够沉淀核酸，并且无需洗盐。） 10. 弃上清，将离心管倒置于干净吸水纸巾上5 分钟。室温下吹风干燥。（提示 可将试管至 于超净台吹风干燥。如果管底有较多液体聚集，可盖好管盖后，轻弹管底数次，将液体分散 挂在管壁上，再打开管盖吹风。） 连接 向回收DNA 的试管中加入8μL 双蒸水，盖紧，弹击管底使液体尽量接触管壁。瞬时离 心将液体甩到管底，再加入1μL ligase Buffer，1μL T4 ligase （连接酶）。弹击管壁混匀，瞬时 离心将液体甩到管底。 置4 ℃过夜。 （提示Ligase Buffer 应该在首次融解后分装，每管可 2-3μL，-20℃存储。 4 ℃过夜可获得最多的转化克隆。） 二、PCR 产物接入质粒的克隆 简介： 取100μL PCR