[农学]细胞培养.pptVIP

一、细胞培养 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内（in vivo）的功能活动是十分困难的。但是如果把活细胞拿到体外（in vitro）培养进行观察和研究，则要方便得多。活细胞离体后要在一定的生理条件下才能存活和进行生理活动，特别是高等动植物细胞要求的生存条件极其严格，稍有不适就要死亡。所以细胞培养技术（cell culture）就是选用最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术。 （一）动物细胞培养 细胞培养方式大致可分为两种： 群体培养（mass culture），将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合（confluence）后形成均匀的单细胞层； 克隆培养（clonal culture），将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中，各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经过生长增殖每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆（clone）。 目前实验室中常用的几种细胞系 原代培养（primary culture）： 初代培养，指直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。 一旦已进行传代培养（subculture）的细胞，便不再称为原代培养，而改称为细胞系。 传代（passage）： 将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶即称为传代或传代培养。 培养细胞的“一代”，不表示细胞分裂一次，而是指培养细胞从接种到再次转移培养的过程。在一次传代培养中，细胞能倍增3-6次。 细胞系（cell line）： 原代培养物成功传代后，则称之为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（finite cell line）； 已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（infinite cell line）。 无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。无限细胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接触抑制和无异体接种致癌性；有的不仅有永生性，异体接种也有致瘤性 。 细胞株（cell strain）： 通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物称为细胞株。 细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。 再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株（substrain）。 克隆（clone）： 亦称无性繁殖系或简称无性系。对细胞来说，克隆是指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。 二倍体细胞（diploid cells）： 染色体数目与原供体二倍细胞染色体数相同或基本相同（2n细胞占75％或80％以上）的细胞群。二倍体细胞在正常情况下具有限生命期，故属有限细胞系。 无菌操作技术 体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。即便使用设备完善的实验室，若实验者粗心大意，技术操作不规范,也会导致污染。因而,为在一切操作中最大可能地保证无菌，每一项工作都必须做到有条不紊和完全可靠。 无菌技术/无菌操作(antiseptic technique) 【培养前准备】 在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。 根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。 这可以避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。 【操作野消毒】 无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面—次(拖布要专用) 紫外线照射消毒30-50min 超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗。然后紫外线消毒30min。 在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线 消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线降低消毒效果。 —些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。 【洗手和着装】 原则上和外科手术相同。平时仅做观察不做培养操作时，可穿着细胞培养室内紫外线照射30min的清洁工作服。在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用75％酒精消毒手。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。 【火焰消毒】 在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，如按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。 培养瓶、滴管、试管、吸管、接种环、接种针 细胞培养前的准备工作 FBS的分装 配备RPMI 1640 培养液（medium） 配备PBS缓冲液（buffer） PBS[Ca2+, Mg2+（-）]