[理学]毛细管电泳.ppt

第20章 毛细管电泳法( Capillary Electrophoresis CE ) 概述 20.1 CE 的基本原理 20.2 CE 的分离模式 20.3 毛细管电泳仪 20.4 CE 在医药中的应用进展 概述 电泳法的发展史(Phylogeny)： 电泳现象早在18世纪就被发现。 1909年，L.Michaelis提出“电泳 (electrophoresis) ”这一术语，他的实验是用于测定蛋白质的等电点。 1937年，瑞典科学家A.Tiselius 成功研制出界面电泳仪，并建立了移动界面电泳法，用于人血清蛋白的分离。 Tiselius于48年获诺贝尔化学奖。 花絮 1937年，Tiselius(瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和α、β、γ球蛋白； 发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定； 第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪； 1948年，获诺贝尔化学奖； 界面电泳 ：在没有惰性支持物的液体接界面上进行的电泳。 区带电泳： 是在溶液中加入一些惰性物质或凝胶物质作为支持物，泳动物质在支持物间隙中移动的电泳方法。 避免对流的干扰。 常压电泳：电位梯度 ? 50V/cm 高压电泳：电位梯度 ? 50V/cm 传统电泳的缺陷： （1） 焦耳热效应：电流通过电泳介质而产生的热效应。 使电泳分离介质温度分布不均匀，引起溶液对流，从而导致区带展宽，降低分离效率。焦耳热效应随电场强度的增大而迅速加剧，限制了高电压的使用。 （2）无法在线检测，定量精度较差。 2.高效毛细管电泳技术 1981年，Jorgenson．和Lukacs 使用75μm内径的熔融石英毛细管，电泳分离氨基酸和肽，成为高效毛细管电泳划时代的里程碑。至此，出现了毛细管电泳技术。 80年代以来，诞生了很多新的毛细管电泳方法，如毛细管凝胶电泳和毛细管等电聚焦电泳。 88年商品化HPCE问世，高灵敏度柱上检测器的发展使HPCE在世界范围内蓬勃开展。HPCE已成为电泳领域发展最快的新分支。 高效毛细管电泳法与高效液相色谱法比较 （1）分离过程： 相同 HPCE 与HPLC 都是一种液相分离分析技术。都是差速迁移过程，可用相同的理论来描述,如保留值、塔板理论和速率理论等。 （2）分离原理：不同（驱动力不同） HPCE：带电粒子在电场中发生定向移动，依据粒子所带电荷数、形状、离解度等不同所产生的差速迁移而分离。 　HPLC：不同组分在两相中的分配系数不同而分离。 （4）应用：二者相互补充 HPCE在生物大分子分离方面，在分析速度和效率、样品和试剂用量方面有优势，但在样品制备和定性、定量重复性等方面不及HPLC。 20.1 毛细管电泳的基本原理 一、 电泳和电泳淌度 二、 电渗和电渗率 三、表观淌度 四、 分离效率和谱带展宽 五、 分离度 一 、电泳和电泳淌度 二、电渗和电渗率 ?eo—电渗率，单位电场下的电渗流的线速度 电渗流的控制： 电渗流是毛细管电泳的基本操作要素，为了优化分离，有必要对它进行控制。 电渗流的控制要求对毛细管表面及缓冲液的粘度进行调节。 （1）电场强度 （2）缓冲溶液的pH（影响管壁带电情况） （3）缓冲溶液的浓度和离子强度（影响Zeta 电势） 三、 表观淌度 在毛细管电泳中同时存在电泳流和电渗流，所以带电粒子在电场中的迁移速度由两者同时决定，可表示为： 四、 分离效率和谱带展宽 1. 柱效参数－理论塔板数和塔板高度 2.引起带展宽的因素 （1）扩散 （2）自热（焦耳热） 焦耳热通过毛细管壁向周围环境散逸时， 在毛细管内形成径向温度梯度（管壁温度?管轴心温度） 焦耳热和温度梯度的控制 焦耳热的大小与毛细管尺寸、缓冲液电导及电场强度有关。 操作电压：电压越高，焦耳热越严重。 柱内径：是影响焦耳热的一个重要因素。内径越小，焦耳热的影响越小。通常毛细管电泳采用尽可能小的柱内径。 缓冲溶液的浓度：浓度增加，焦耳热增加。 目前常采用内径为 25～75 ? m 的毛细管柱 采用外管壁涂层技术。 (3)吸附 毛细管电泳中的吸附作用主要指毛细管管壁对被分离物质粒子的作用。 主要原因： 阳离子溶质和带负电的管壁离子相互作用；疏水作用。 吸附作用与毛细管表面积与体积之比有关。 内径越细，吸附越严重。 五、 分离度 分离度：将淌度相近的组分分开的能力。 对上面的公式处理，可得： 20.2 毛细管电泳的分离模式 一、毛细管电泳的分类 二、 毛细管区带电泳法（Capillary Zone Electrophorsis,CZE） 毛细管区带电泳（又称毛细管自由溶液区带电泳法）是毛细管电泳中最简单、最基本、使