关于柑橘青果病的两种韧皮部杆菌的PCR检测.docVIP

本科毕业论文(设计) 外文翻译 题 目 关于柑橘青果病的两种韧皮部杆菌的PCR检测 关于柑橘青果病的两种韧皮部杆菌的PCR检测 原文来源：Sandrine Jagoueix,Joseph Maric Bove,Monique Garnier.PCR detection of two‘Candidatus’liberobacter species associated with greeing disease of citrus.Molecular and Cellular Probes,1996,10:43～50 桑德里.乔格，约瑟夫.玛丽波维，莫里库.卡利 （法国波尔多第二大学国家农业研究院细胞分子生物实验室） 摘 要：青果病是柑橘上一种严重的并且广泛传播的病害，在世界范围内有两个主要柑橘生产区域亚洲和非洲。它是由一种难以分离和培养的韧皮部杆菌引起的，目前是从核糖体DNA序列来鉴别出来。该病菌是属于韧皮部杆菌属难培养的新种类，在变形菌门的阿尔法部分上，这两种病菌可以被鉴别出来，即亚洲株系和非洲株系。在这篇论文里，我们通过PCR方法扩增16SrDNA1160bp序列片段，来检测柑橘树上的两种病菌，分辨出两者之间的差别和获得扩增后的提取物。 关键词：柑橘青果病，韧皮部杆菌，16SrDNA,PCR诊断 前 言 青果病是柑橘树上危害严重和广泛传播的病害，分布在东亚（从巴基斯坦到中国），南非和东非，阿拉伯半岛和印度洋海域的留尼旺岛，毛里求斯和马达加斯加。由于昆虫媒介可以携带这种病菌，所以这种病害威胁着其他柑橘种植区域（像美洲和地中海国家），例如柑橘木虱、非洲木虱相继在南美和大西洋岛出现。 青果病是由一种韧皮部限制性细菌引起的，由于这种细菌难培养，当前把它作为一个特征。这种可以被定义但难以培养的属名称为韧皮部杆菌属，默里和肖勒夫把它定义为难培养的有机体，并且归属于细菌类。我们也发现亚洲韧皮部杆菌和非洲韧皮部杆菌属于两种不同的菌系：亚洲菌系和非洲菌系。两种DNA探针：IN-2.6和AS-1.7包含核糖体蛋白质的基因（称作β-操纵子，知道其片段结构和大小），分别由亚洲菌系和非洲菌系制备的。通常圆点印迹杂交化验法，可以在感染的柑橘果园里采集柑橘叶片样片，分别检测青果病病菌种类。杂交化验法的灵敏度和电子显微镜相近，这是一种适用于早期的检测方法。用两种不同的探针来检测两种不同的韧皮部杆菌很有必要（韧皮部杆菌在阿拉伯半岛和留尼旺岛，毛里求斯岛这些地方都相继发现过） 实际上，抽提DNA进行圆点印迹法能让我们在很短时间内迅速的进入下一步骤。PCR是一种简单、快捷和灵敏的方法，的确如此，我们把它作为早期DNA克隆的目的，得到亚洲菌系和非洲菌系的16SrDNA的基因序列。通过基因序列比较分析，模板和扩增的韧皮部杆菌的核糖体DNA有明显的相同部分。在这篇论文里，我们研究最初细菌的特异性，必须要求扩增从柑橘叶片中抽提的韧皮部杆菌属的rDNA。上面的扩增片段中，可以用扩增DNA的限制性内切酶来区分不同的韧皮部杆菌的种类。 1.材料和方法 1.1植物材料 长春花（蔷薇属）和甜橙（柑橘科），均受到亚洲菌系和非洲菌系的两种不同病菌的感染，并体现初出早期的症状。这两类植物，其中感染亚洲菌系的主要放置在白天30℃和晚上25℃的温室中；感染非洲菌系的放置在白天25℃和晚上20℃的温室中；另外健康的长春花和柑橘植物通过播种，在25/ 20℃的温室里生长获得。 1.2提取植物中的DNA 使用默里和汤普生提出的常规CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法来抽提DNA。 提取柑橘叶片研磨液，准备PCR。 1.2.1方法1： 取0.5g的叶片中脉，用刀片切成细小的碎片放在一个碟状的可使用的研钵中，加入1ml的0.3M NaCl。研磨成浆液状态，用注射器收集进行100g的低速离心时，进行离心。PCR既可以直接在10折至100折的稀释的悬浮液上完成，也可以在悬浮液以16000g离心5min后形成的沉淀物和用100ul灭菌水的稀释液上进行。 1.2.2方法2： 取叶片中脉（大约0.1g至 0.3g），用刀片切成细小的碎片放在一个碟状的可使用的研钵中，加入1ml的TE缓冲液（10mM Tris PH 8.0,400 mM EDTA,1%SDS）,另外加入0.25mg蛋白酶K。将研磨成浆液转移到Epp