[工学]第八章-微生物药物的分离与精制.pptVIP

知识目标：1.了解微生物工程下游加工过程的原理和方法。 2.掌握各种沉淀方法。 3.掌握溶剂萃取的原理和方法。 技能目标：1.能够正确地选择离子交换树脂和控制操作条件。 2.熟练掌握各种沉淀的操作与结晶方法。 第一节 概述 一、微生物工程下游加工过程的特点 培养液(或发酵液)是复杂的多相系统，含有细胞、代谢产物和未用完的培养基等。分散在其中的固体和胶状物质，具可压缩性，其密度又和液体相近，加上黏度很大，属非牛顿性液体，使从培养液中分离固体很困难。 培养液中所含欲提取的生物物质浓度很低(几种不同类型产品的浓度示于下表中)，但杂质含量却很高，特别是利用基因工程方法生产的蛋白质，常常伴有大量性质相近的杂质蛋白。从低浓度的混合物中分离纯组分，需要较大的能量。 下游工程 第一个特点---即起始浓度较低而杂质又较多，最后成品要求达到纯度又较高，因此常需多步纯化操作。一个包含6步操作的纯化过程，即使每步作都较完善，收率达到90%，总收率也只有53%。可见，尽量减少提取步骤是相当重要的。 第二个特点---是欲提取的生物物质通常很不稳定，遇热、极端pH值、有机溶剂会引起失活或分解，特别是蛋白质的生物活性与一些辅因子(cofactor)、金属离子的存在和分子的空间构型有关。一般认为剪切力( shear)会影响空间构型和使分子降解，对蛋白质的活性影响很大。最近的研究则表明，当蛋白质分子处于气液交界面上或与膜结合的蛋白质均对剪切力较敏感，而溶解的蛋白质则受影响较小。 第三个---特点是发酵或培养都是分批操作，且微生物总有一定的变异性，故各批发酵液不尽相同，这就要求下游加工有一定的弹性，特别是对染菌的批号，也要求能处理。 二、微生物工程下游加工的一般过程和单元操作 大多数产品的下游加工过程常常按照生产过程的顺序分为4个步骤，即发酵液的预处理和固液分离、初步纯化(提取)、高度纯化(精制)、最后纯化(成品加工)，见后面图所示 发酵液的预处理和固液分离是采用凝聚和絮凝等技术，加速固、液两相分离，提高过滤速度。发酵产品如果是胞内产物，首先要进行细胞破碎，再分离细胞碎片。 初步纯化即提取，主要是除去与目标产物性质有很大差异的物质，使产物浓缩以及产品质量提高。常用方法有沉淀、吸附、萃取等。 高度纯化即精制，采用对产品有高度选择性的分离技术，除去与产物理化性质相近的杂质。典型的方法有层析、离子交换等。 成品加工是为了获得质量合格的产品，常用浓缩、结晶、干燥等技术方法。 第二节 发酵液的预处理及固液分离 发酵液的预处理及固液分离是发酵液下游加工的第一步操作。预处理的目的是改善发酵液的性质，去除部分可溶性杂质，分离菌体和其他悬浮颗粒，以利于提取和精制工序的操作。在预处理中常用酸化、加热、加絮凝剂等方法，而固液分离则常用过滤、离心等方法。如果目的产物存在于细胞内，则需要收集菌体或细胞，并对细胞进行破碎。 一、发酵液的预处理 1.高价无机离子的除去 发酵液中主要的无机离子有Ca2+，Mg2+，Fe3+等。 去除钙离子通常使用草酸。草酸为弱酸，对发酵产物破坏作用较小。 去除Mg2+可加入三聚磷酸钠，它和Mg2+形成可溶性络合物，可消除对离子交换的影响。 去除铁离子可用黄血盐。黄血盐与铁离子形成普鲁士蓝沉淀。 2.杂蛋白的除去 A-沉淀法 注意：仅靠调pH值不能使大部分蛋白质沉淀，还必须与其他方法共用。在酸性溶液中，蛋白质与一些阴离子如三氯乙酸盐、水杨酸盐、过氯酸盐等形成沉淀;在碱性溶液中，能与Ag+,Cu2+,Zn2+等阳离子形成沉淀。或者加入碱金属中性盐作为脱水剂，破坏蛋白质分子的水化层，使蛋白质沉淀。 B-变性法蛋白质变性后，溶解度降低真至沉淀。使蛋白质变性的方法很多，最常用的是加热法。它是在目的产物耐热性允许的范围内，采用加热处理发酵液的方法。变性法也有一定的局限性,如加热法只适合对热较稳定的目的产物，过酸过碱可能会导致某些产物失活。 C-吸附法 利用某些吸附剂或沉淀剂的吸附作用去除杂蛋白质。例如在枯草芽孢杆菌发酵液中，常加入氯化钙和磷酸氢二钠，两者生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体、其他不溶性粒子吸附进去、包裹在其中而除去。 3.色素及其它物质的去除 色素可能是微生物代谢过程分泌的，也可能是培养基(如玉米浆等)带来的。对于药用发酵产品，特别是针剂产品要求不含色素、热源物质和毒素物质等。常用的脱色方法有离子交换剂、离子交换纤维、活性炭等材料的吸附法。 二、离心过滤与固液分离 发酵液中除了发酵产物，还含有大量的固体如菌体。为了方便提取和精制的进行。应该将菌体与发酵液分离。菌