基因工程问答题456_-_副本.docVIP

问答题 获取目的基因的方法有哪些，常用的有哪些，了解如何选择获取目的基因？ 答：化学合成法、PCR扩增法、从构建的基因组成或cDNA文库中筛选法、mRNA差别显示技术获得差异表达的基因、图位克隆获得目的基因、转座子标记法、酵母双杂系统分离目的基因及生物信息法分离和鉴定目的的基因。 （1）.已知目的基因的部分序列或其他物种同源基因的保守序列（RCR相关技术或以已知基因作作探针通过核酸分子杂交从基因文库中筛选）。 （2.）已知基因表达的蛋产物（制备抗体通过免疫学方法筛选表达cDNA文库或PCR相关技术获取目的基因） （3）.已有目的基因紧密连锁的分子标记或有可操作的功能转座子（以基因文库为核心，通过转座子签记法或图位克隆法） （4）.组织、细胞或诱导差异表达的基因（采用DDRT-PCR获得获取差异片段后筛选基因文库保留）。 2.化学获取目的基因的前提有哪些，该方法的用途有哪些？ 答：前提：DNA的基因序列已知 用途：（1）.直接合成天然基因。 （2）.合成引物（20mer左右） （3）.合成探针序列。 （4）.合成连接子和接头。 3.基因组文库的大小的计算公式： 答：N=ln（1-p）/ln（1-f） P代表筛选几率，一般为99% ，f是插入片段和基因组大小的比值 4.基因组文库构建的一般步骤： （1）.生物基因组DNA的提取和片段. （2）.载体的选择和制备. （3）.DNA片段和载体的连接. （4）.重组体转化宿主细胞. （5）.初库的扩增. 5.cDNA文库构建的一般步骤： （1）.总RNA的提取. （2）.mRNA分离纯化. （3）.逆转录合成双链cDNA (4).cDNAde 克隆 6.载体上理想的酶切位点应符合的条件： （1）.位于载体上特定的酶切位点要尽可能少，最好是单一酶切位点. （2）.在酶切位点之前要有一个较强的启动子，使插入的目的基因可在改启动子的指导下高效表达. （3）.选择的载体必须在连接重组后对基因转录和翻译过程中编码区读框不改变. 7.平端连接情况下，实现黏性末端连接的方法有哪些，并说明优缺点。 答：（1）.同聚物加尾连接平末端DNA片段： 优点：能把任何片段连接起来，可避免载体或外源DNA片段自身环化. 缺点：不能把连接片段再切下来. （2）.衔接物或接头分子连接平末端DNA片段。 衔接物：优点：可以用内切酶把插入片段切下来；能够载体连接上Polyinker 缺点：如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下来完整的插入片段. 连头分子：优点：脸上就能用. 缺点：接头与接头会彼此以黏性末端连接在一起，影响与DNA片段的连接. 8.DNA体外连接的结果及注意事项。 结果：载体与载体、DNA与DNA、重组子、反向连接 注意事项：（1）.插入片段与载体的酶切位点近可能互补。尽量避免平末端连接，若相同的酶或同尾酶切割需要鉴定方向. （2）.通常情况下，要 保证定向连接，因此最好选择双酶切割连接. （3）.插入基因的开放阅读框（ORF）正确. （4）.防止载体自我连接. 9.了解黏性末端连接的几种情况。 （1）.同种酶产生的黏性末端连接。 答：自身连接，多个外源DNA串联与载体连接，重组体（正、反方向）.多个载体与多个外源DNA片段混连. （2）.同聚物加尾法，加人工接头法，加衔接物法，PCR引入酶切位点法. 10.大肠杆菌作为受体细胞应具备的条件. 答：（1）.感受态细胞. （2）.限制性内切酶缺陷性. （3）.DNA重组缺陷 （4）.符合安全标准. 11.转化的过程。 答：吸附、转入、自稳、表达 12.PEG（聚乙二醇）使细胞壁具有通透性，允许DNA进入。CaCl2使细胞膜具有通透性，允许DNA进入。 13外源基因导入植物细胞的方法。 答：转化、转染、微注射技术、电转化法、基因枪技术、脂质体介导法、其他方法