人TNF(elisa)2PPT.ppt

实验二 [实验内容] 免疫标记技术 免疫标记技术 原理 免疫标记技术：即用酶、同位素荧光、发光物质等标记技术代替传统的肉眼可见反应，其特异性、敏感性均增加，且可以定性、定量甚至定位；缺点是需特殊精密检测仪。 免疫酶标技术：用酶标记的已知抗原（或抗体）来检测未知的抗体（或抗原）的一种免疫学标记技术。它同时利用了酶的高效催化效能及Ag-Ab反应的高度特异性；据底物被酶分解后显色的深浅可反映待测样品中Ag、Ab的含量；故可以定性、定量甚定位。 定义： 是固相吸附技术与免疫酶技术的结合，具有特异性高、敏感性强、稳定好、操作简便等优点，是当时应用最广的一类酶免疫测定法。其中固相免疫技术即将抗原或抗体用物理方法连接在顾相上形成免疫吸附剂。 常用的固相吸附剂：聚苯乙烯、NC膜 酶： HRP（辣根过氧化物酶）、AKP（碱性磷酸酶） 底物：OPD（邻苯二胺）、 DAB（二胺基联苯胺）、 TMB（四甲基联苯胺） 检测仪器：酶标仪 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) ELISA双抗体夹心法测定原理 酶标板显色结果 酶标板显色结果 酶标仪 原理与方法 ? 间接法 双抗体夹心法 抗原竞争法 包被物 Ag Ab Ab 酶标物 Ab2(抗抗体) Ab Ag 待测物 Ab1(一抗) 多价大分子抗原 抗原、半抗原、抗体 间接法 双抗体夹心法 抗原竞争法 间接法测定示意图 间接法测定抗体示意图 双抗体夹心法测抗原示意图 竞争法测抗原示意图 洗涤3次 洗涤3次 洗涤3次 抗体包被（4℃过夜） 加待测血清及对照液，生物素标记抗体（37℃孵育600min） 加底物显色（37℃孵育15min）, 终止酶反应， 肉眼观察实验结果 加亲和链霉素-HRP（37℃孵育30min） 双抗体夹心法测定人TNF实验流程 1.使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。 2.根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。标本用标本稀释液1：1稀释后加入50ul于反应孔内。 操作步骤 3. 加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1小时。 4 . 甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。 5. 每孔加入60ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。 甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。 7. 每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育10分钟。避免光照。 8. 取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。 9. 在450nm波长处测定各孔的OD值。