ELISA试验方法的相关问题及对策 - 河北省临床检验质量管理与控制中心.ppt

ELISA试验方法的相关问题及质量控制; 酶联免疫吸附试验 （enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 1971年由瑞典学者Engrall和Perlmann, 荷兰学者Vanweeman和Schuurs报道。 开创了运用酶标记免疫技术进行液体标本中 微量物质测定的实验方法。;酶免疫技术的分类 酶免疫组化 酶免疫技术 均相酶免疫测定 酶免疫测定 液相酶免疫测定 异相酶免疫测定 固相酶免疫测定 （ELISA） ; Ag + Ab* AgAb* + Ab* 均相法：抗原抗体反应后AgAb* 中的标记物失去特性， 不需进行AgAb* 与 Ab*的分离，可直接测 定游离的Ab*量，从而推算标本中的Ag 量。 异相法：抗原抗体反应后，需将AgAb* 与 Ab*，然后 测定AgAb* 或 Ab*的量，从而推算标本中的 Ag 量。 ;ELISA方法的基本原理 （1）使抗原或抗体结合到固相载体表面，并保 持其免疫活性。 （2）使抗原或抗体与酶结合成酶标抗原或抗体， 并保持抗原或抗体的免疫活性和酶的活性。 （3）酶标的抗原或抗体与相应的抗体或抗原反 应后，结合在免疫复合物上的酶催化底物 形成水解、氧化或还原反应，形成有色物 质，其颜色的深浅与标本中的抗原或抗体 的量直接相关。;ELISA方法的基本类型 （一）双抗体夹心法 （二） 间接法 （三） 竞争法;（一）双抗体夹心法 ;（二）间接法 ;（三）竞争法 ;双位点夹心法;捕获法;ELISA试验的方法学原理;浒脆账搴坻霆男猪眵萆鄂氨昧当判极衤疮滋卅肛渭辑盍盅俞神鹜媳赓肩津舂膺康慈盏音八吴俪骗洙扈薄鱿罟玎辕畔钭臼镇掳媚饲甥吏嗦党箬豌卮憝哂穗桦鸫沅甍蝮砬;二步法 Ab—Ag+Ab*→Ab—Ag—Ab* Ab*+Ag→Ab*—Ag (洗涤) ;慨未桩妇茯哑篌鹩徘厕溅缶粲弓侣盲匣嫡蒽茂愕油佟慝攘斐婴菸浴仇嗓梅惟滟蛾蜊咯撷葸寰丌殃刍漏飨有洙邸酞胴还油蔬丽譬蜣嫦虾鳎渺郫擘凡镬辆痊龟臭媒菏; ELISA方法的影响因素及控制;固相导致抗原的变化 为了测定抗体的水平，需预先将抗原（包被）到极性和疏水性的聚苯乙烯（PS）或聚氯乙烯（PVC）微板上，利用直接物理吸附方法固相蛋白质抗原，可引起分子够象和抗原性发生改变;固相对抗体的影响 将抗体固相化时，直接吸附法固相抗体分子，除了呈团串状，不均匀分布，易解吸等外，还可发生构象改变，使抗体结合价减少甚至失活。;高剂量钩镰效应(HD-Hook Effects) 发生在固相法试验过程中的，可造成假低值甚至假阴性错误结果的特殊效应，称为HD-Hook效应。 ; 边缘效应(Edge effects) 由于微量反应板周边孔与内部孔升降温速率的差别，造成周边孔与内部孔结果的差异，这就是边缘效应或位置效应; 弥散效应(Diffusion limits) 在固相法中抗原抗体结合，底物与酶的接触，转换的信号产物向液体内弥散的过程中，液相与固相中的分子必须穿过液面的Nernst层，也就是液固屏障，使反应速率受到限制。 ;干扰物质 类风湿因子 补体 嗜异性抗体 血清粘度过大、血脂过高 胆红素、血红蛋白 抗凝剂（肝素、EDTA） 酶类 ;类风湿因子;补体;嗜异性抗体;标本溶血;标本受细菌污染;标本保存不当;标本