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基因工程genetic engineering ??1. 基因工程诞生的理论基础 基因工程的诞生依赖于在此之前生命科学基础理论的发展成就，概括起来主要包括三个方面： ⑴ 40年代确定了遗传物质是DNA，它是遗传信息的载体。 ⑵ 50年代发现DNA分子的双螺旋结构并揭示了半保留复制的机理，揭示了基因的自我复制和表达的机理。 ⑶ 50年代末至60年代初，相继提出了“中心法则”和操纵子学说，并成功破译了遗传密码，从而阐明了遗传信息的流向和表达问题。 2．工具酶的发现为基因工程的诞生奠定了技术的基础： 3．基因工程的诞生 1972年H.Boyer 和 P.Berg 第一次完成了DNA的体外重组实验，用E.coRI在体外对SV40的DNA和λ噬菌体的DNA进行了消化，然后用T4连接酶将消化后的DNA片段进行了连接，结果获得了重组的杂种DNA分子。 1973年S.Cohen 也成功的进行了另一个体外重组实验，他将编码有卡那霉素抗性基因的大肠杆菌R6-5质粒DNA与编码有四环素抗性基因的另一种大肠杆菌质粒pSC101 DNA混合后加入内切酶EcoRI对DNA进行切割，再用T4连接酶将它们连接成重组分子，用这种连接后的重组DNA转化大肠杆菌，结果发现，某些转化菌落表现出了既抗卡那霉素又抗四环素的双重抗性特征。 以上两个实验带给人们的启示： DNA是可以在体外进行切割和拼接的 利用细菌细胞可以快速的复制DNA并能够合成蛋白质。 这两个实验也标致着基因工程技术的诞生 基因工程所使用的名称： 重组DNA技术(recombinant DNA technique) 遗传工程(genetic engineering) 基因工程(gene engineering) 基因操作(gene manipulation) 基因克隆(gene cloning) 分子克隆(molecular cloning) 基因工程的基本内容： 1．将两种不同来源的DNA－－即目的DNA和载体DNA提取纯化。 2．用限制性内切酶处理DNA。 3．用连接酶将切开的不同源的DNA连接到一起，构成重组DNA。 4．将重组DNA转化到大肠杆菌中。 5．通过大量的培养细菌，以达到扩增目的基因或表达蛋白的目的。 基因工程的目的： 进行分子克隆 表达重组基因所编码的蛋白质 工具酶 一、?限制酶(restriction enzyme) ??? 全称限制性核酸内切酶、简称限制酶或内切酶。 1． 限制酶的分类 限制酶有三种：I型、II型、III型。 2. 限制酶的命名 一般的限制酶通常由四个拉丁文字母组成 第1个字母代表产生该酶的细菌的属名， 第2、3个字母代表产生该酶的细菌种名 第4个字母代表产生该酶的菌株号。 3. 限制酶的识别和切割位点 根据Ⅱ型酶种类割双链DNA产生3种不同的切口： ⑴产生平末端 ⑵产生5’端突出的粘性末端 ⑶产生3’端突出的粘性末端 6. 限制酶使用的条件 ⑴　缓冲系统： 50mmol/L tris.Cl 10mmol/L Mg++ 1mmol/L DTT NaCl ⑵ 反应体积 ⑶ 反应温度和时间 ⑷ 限制酶的商业化 7. 限制酶的商业化 试剂公司的名称： Promaga公司 安玛西亚公司 大连保生物公司 北京赛百胜公司 北京华美公司 购买酶时的注意事项：价格因素 供货时间 运输方式 酶的保存 修饰酶 ⒈逆转录酶种类： 禽类成骨细胞性白血病病毒(AMV)逆转录酶 小鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶 ⒉ T4DNA连接酶 从噬菌体中提取，用于DNA的连接 ⒊ 碱性磷酸酶 可将DNA或RNA5’的磷酸去除，可用于制止不希望发生的连接反应进行。 ⒋末端脱氧核苷酰转移酶 用于将已标记好的单核苷酸加到DAN的3’端上，起到标记的作用；有时也可用于DNA片段的同聚尾的形成。 载体(vector)在基因工程中的作用: 将外源DNA插入其中，并一同转化或转染到宿主细胞中，能够稳定的保存下来，完成外源DNA克隆和表达的功能。 载体所必需的条件 1必须有自身的复制子，并能携带重组DNA一起复制。 2载体分子上必须有限制性内切酶位点即多克隆位点。 3载体必须具有可供选择的标置，便于重组分子的筛选。 4载体分子尽量