4.5 ELISA法检测血清抗结核抗体PPT.pptVIP

免疫标记技术 定义： 将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。 分类： 放射免疫测定法：131I，32P 免疫荧光技术：FITC，PE 免疫酶测定法：HRP，AP 用标记物标记抗体或抗原进行抗原抗体反应借以提高免疫学诊断的敏感性 荧光素 ：异硫氰酸荧光素（黄绿色荧光）、藻红蛋白、 罗丹明（红色荧光） 放射性同位素： 125I、131I 酶：辣根过氧化物酶、硷性磷酸酶 免疫荧光检测法（IFA） 放射免疫检测法（RIA） 酶免疫检测法（EIA） 免疫标记技术 液相（ELISA）、固相（免疫组化技术） 酶免疫测定法(Enzyme ImmunoAssay,EIA) 用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。 辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP) 特点： 高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性 高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，可定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值 分类： 酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体 酶免疫组化法： 组织中或细胞表面的抗原。 酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA) 用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗体或抗原的方法。 1.定义 2.分类 直接法（ direct ELISA）： 间接法（Indirect ELISA）： 将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗 检测液相中未知抗体 双抗体夹心法（Sandwich ELISA)： 竞争法（Competitive ELISA) ： 将特异性抗原与固相载体相连,加入合适的抗体（待测标本）,使之与抗原结合,漂洗时不被冲走。结合的抗体用酶标抗人IgG进行检测。 ELISA间接法--主要用于检测抗体 原理（以间接ELISA为例）： 显色 间接法测抗体 - E E E E E E E E E + 实验步骤： 显色 封闭 包被Ag 洗涤 加待测血清 Ab 洗涤 加酶标抗抗体 洗涤 终止 酶标仪测OD值 (在492 nm 波长下) 固相 聚苯乙烯 Ag或Ab吸附到固相上的过程,称为包被 常用酶及其底物 常用底物： 邻苯二胺(OPD)：反应显橙黄色，应避光，致癌性。 四甲基联苯胺(TMB)：反应后呈蓝色，无需避光，无致癌性, 但水溶性差。 常用底物： 对硝基苯磷酸酯(p-NPP)：产物为黄色。 AP灵敏性高于HRP，但不易获得纯品，且稳定性低于HRP、价高，故应用不如HRP普及。 1.辣根过氧化物酶(HRP) 2.碱性磷酸酶(AP) HRP的底物系统 DH2+H2O2→ → → D+2H2O HRP 邻苯二胺(OPD), 反应中作为供氢体 H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高 有色产物 供氢体 受氢体 OPD反应后显黄色，加浓硫酸终止反应后呈棕黄色 　HRP的常见底物：OPD 酶和酶作用底物 酶标仪 实验内容：  ELISA间接法测定抗结核抗体 实验材料 PPD(结核杆菌蛋白衍生物) —— 抗原 抗结核抗体 —— 待测抗体（ 待测血清） HRP标记羊抗人IgG —— 二抗 包被缓冲液：0.05M pH 9.6 碳酸盐缓冲液CB： 配制100ml 洗涤液：含0.05% Tween 20 的0.01M pH 7.4 PBS: 配制1500ml 底物缓冲液： pH 5.0 磷酸盐—柠檬酸缓冲液 :配制50ml 底物：OPD20mg，底物缓冲液50ml，30% H2O2 100μL:临用时配 温箱，酶标板 实验方法 1.抗原的处理： PPD冻干粉剂 用包被缓冲液稀释至10μg/ml 2.包被抗原： 取酶标板，加入抗原稀释液：100μL/孔（10μg/ml） 4℃，湿盒内，过夜 取出包被好抗原的酶标板，甩干孔内液体 注满洗涤液（200μL/孔）洗涤3次，1-2min/次 3.加待测血清 标记各孔，加入相应液体100μL/孔 2 3 待测 2 待测 1 待测 3 4.加二抗： 37℃，湿盒内，40min 甩干孔内液体 以洗涤液（200μL/孔）洗涤3次，1-2min/次 各孔加入酶标二抗100μL/孔 37℃，湿盒内，40min 5.显色： 甩干孔内液体 以洗涤液（200μL/孔）洗涤3次，1-2min/次 加入底物100μL/孔 避光显色，10min 6.观察结果 预期结果 阳性：显色为黄色 阴性：无色 1 2 3 4 阴性 阴性 阳性 阳性 注意事项 洗涤彻底，避免交叉污染。 按顺序加样，孔底无气泡。 包被和温育在湿盒内进行。 前面所讲述的凝集反应、沉淀反应以及今天要进行的补体结合反应均属于经典抗原抗