第六章3高效液相色谱法 实用中药鉴定学课件.pptVIP

高效液相色谱法 高敏液相色谱法（HPLC）：采用高压输液泵将流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。注入的供试品由流动相带入柱内，各成分在柱内分离后，先后进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。 与气相色谱法相比较，具有适用范围广、流动相选择性大、色谱柱可反复应用、流出组分易收集等特点，适用于中药材及中成药的质量分析。HPLC法的流动相是具有不同极性的单一溶剂或不同配比的混合溶剂、缓冲液等液体溶液；常用色谱柱填充剂有硅胶（正相色谱）、化学键合固定相（如十八烷基硅烷键合硅胶、离子交换树脂填料、凝胶等）； 高效液相色谱法 选择量一般为数微升，柱温多为室温，检测器常用紫外光检测器，所用仪器为液相色谱仪。 HPLC法不受样品挥发性的约束，只要求样品能制成澄清溶液而不需要气化，所以特别适用于挥发性低、热稳定性差、分子量大的高分子化合物以及离子型化合物（如氨基酸、蛋白质、生物碱、核酸、甾体、类脂、维生素以及无机盐类等）的分离和鉴定。 蛋白质电泳色谱法 适用于含蛋白质及氨基酸类成分中药的真伪鉴定，尤其是动物药及果实种子类中药。 其原理是：利用中药所含蛋白质带电荷的成分，在同一电场作用下，由于各组分所带电荷的性质、数目及分子质量的不同，泳动方向和速度则不同，最终形成的色谱带条数不同而达到分离鉴定的目的。常用方法是聚丙烯酰胺凝胶电泳法。 光谱法 光谱法是通过测定物质在特定波长处或一定波长范围内对光的吸收度而对该物质进行定性和定量分析的方法。 所用波长为λ=200～400nm，紫外光区；λ=400～760nm，可见光区；λ=2.5～25μm（波数4000～400cm-1）红外光区。 常用方法有：分光光度法、紫外－可见分光光度法、红外分光光度法、原子吸收分光光度法。所用仪器为紫外分光光度计、可见分光光度计（或比色计）、红外分光光度计和原子吸收分光光度计。 可见分光光度法 又称比色法，是通过比较中药溶液的颜色对光的吸收度，以测定其某种成分或组分含量的方法，主要用于中药的定量分析和物理常数测定。 A（吸光度）=lg ＝E C L（T为透光率，E为吸收系数，C为100ml溶液中所含被测物质的重量，L为液层厚度） 常用仪器为可见分光光度计或比色计，测定时需用标准品或对照品同时比较，在规定波长处测定对照品和供试品溶液的吸收度后，可用标准曲线法或比较法计算。 紫外光谱法（UV） 利用中药所含主成分或有效成分，在波长λ=200～400nm处有最大吸收波长的原理而进行定性定量分析的方法。所用仪器为紫外分光光度计，所用溶剂在所测波长附近不得产生干扰吸收峰，所配样品溶液的吸收度读数以在0.3～0.7之间误差较小，空白对照应用配制样品的同批溶剂。 紫外光谱法不仅能测定有色物质，而且能测定含不饱和共轭双键的无色物质。中药材的紫外吸收光谱通常是各组分特征吸收光谱叠加而成，在一定条件下，同一种药材应有相同的紫外吸收光谱。但有时对同属不同种药材以及性状和显微鉴别不易区分的近缘物种的鉴定，单纯依靠紫外吸收光谱往往不能达到分离和鉴定的目的，这时可采用导数光谱法来帮助解决光谱干扰问题。 红外光谱法（IR） 通过测定中药粉末、提取物或化学单体的红外吸收曲线，并根据中药各组分官能团红外吸收峰的差异而鉴别中药品种和质量的方法，常用于中药定性鉴别和化合物的结构分析。所用仪器为傅立叶变换红外光谱仪或色散型红外分光光度计。 IR具有特征性强（λ=7～15μm的指纹区，吸收峰多且尖锐），分析速度快，样品用量少，操作简单、应用较广泛等特点。 定性鉴别时，通常固体样品采用溴化钾压片法，液体样品采用液样点于氯化钾或溴化钾片间，在4000～667cm－1范围内测定其吸收光谱，所得吸收光谱应与对照图谱一致；含量测定时，样品液与标准品溶液先后分别装入同一液体吸收池，在规定波数范围内测定吸收图谱并按规定方法作基线及量取峰高计算含量。 原子吸收光谱法（AAS） 根据从光源辐射出的待测元素特征光波，通过供试品蒸汽时，被蒸汽中的待测元素的基态原子所吸收，测定辐射光强度减弱的程度，而求出供试品中待测元素含量的一种方法。 原子吸收遵循一般分光光度法的吸收定律，通过比较对照品和供试品的吸收度，即可求得供试品中待测元素的含量。 本法具有专属性强，检测灵敏度高、测定速度快等特点，是目前测定中药材及中成药中微量元素最常用的方法之一。所用仪器为原子吸收分光光度计。 其他理化分析法 质谱鉴定法（MS）：按照带电粒子的质量与电荷的比值（m/z）大小依次排列形成的质谱图，根据中药提取物的化学成分所显示的分子离子基峰及进一步裂解碎片峰的不同而对中药化学成分进行结构鉴定的一种方法。所用仪器为质谱仪。对中药化学成分结构鉴定时，往往还要辅以IR、UV、NM