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聚合酶链式反应(PCR) 学生: 周爽 导师: 陈国平 教授 2009年9月21日 PCR起源 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制，它是于1971年由 Dr. Kjell Kleppe 提出。他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似PCR前两个周期反应）的实验。 1976年从 温泉中的细菌（Thermus aquaticus）分离出耐高温的DNA聚合酶为PCR的发明奠定了基础. 而现今所发展出来的PCR则于1983由 Dr. Kary B. Mullis发展出来.Dr. Mullis 于1985年与 Saiki 等人正式发表了第一篇相关的论文。此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。 PCR基本原理 双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与引物的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸.三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。  PCR的用途 PCR在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途：(1) 生成双链DNA中的特异序列作为探针；(2)?由少量mRNA生成 cDNA文库；(3) 从cDNA中克隆某些基因；(4) 生成大量DNA以进行序列测定；(5) 突变的分析；(6) 染色体步移；(7) RAPD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析等。 PCR基本成分 缓冲液：10*BUFFER 镁离子 引物：5’引物 引物：3’引物 底物：dNTPs 模板：102~105拷贝 TaqDNA聚合酶 1.PCR反应的缓冲液：10~50mmol/L Tris-Cl 缓冲液，(1/10体积)72℃ 时pH7.2,调节反应体系的pH值，使Taq DNA聚合酶的作用环境维持偏碱性。缓冲液含50mmol/L的KCl可促进引物退火，大于此浓度将会抑制TaqDNA聚合酶的活性。加入适量二甲基亚砜或甲酰胺有利于破坏模板的二级结构。2.镁离子：常用1.5mmol/L （ 25mmol/L,50ul体系加3ul ）Taq DNA聚合酶活性需要Mg2+。Mg2+ 浓度过低，会显著降低酶活性。Mg2+浓度过高又使酶催化非特异性扩增增强。Mg2+浓度还会影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度，从而影响扩增片段的产率。在PCR反应中，Mg2+的总量应比dNTPs的浓度高。其原因是引物、模板、dNTP分子中的磷酸基团可与Mg2+结合而降低游离Mg2+浓度，从而影响Taq DNA聚合酶的活性。 3. dNTPs：在PCR反应中，dNTPs浓度在20~200μmol/L（2.5mM,加0.4-4ul/50ul体系）, dNTP浓度过高可加快反应速度，同时还可增加碱基的错误掺入率和实验成本。反之，低浓度的dNTP会导致反应速度的下降，但可提高反应的特异性及实验的精确性。4.引物：0.1~0.5 μmol/L（50ul体系加0.5-2.5ul引物（10 μmol/L ））引物与模板的摩尔比至少为108：1。如此过量的引物才能确保模板DNA一旦变性就与引物退火，而不能与其自身退火。但引物浓度偏高会引起错配和非特异性产物扩增，且可增加引物之间形成二聚体的几率，降低扩增效率。但如果该比例太低，PCR效率也会降低。 5.耐热DNA聚合酶：2.5~5 u Taq DNA聚合酶具有类似未端转移酶的功能，能催化dNTP加到DNA的3′-OH端。但对4种dNTP聚合到3′-未端的能力不同，对dATP的聚合能力高于其他3种核苷酸，因此PCR产物的末端总是个A. 加过多量的Taq DNA聚合酶会产生非特异性扩增,同时增加成本. 6.模板 在一定范围内PCR产量随模板浓度的升高而显著升高，但模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。为保证反应特异性，一般采用微克水平的基因组DNA或102?105拷贝的待扩增片段作为模板.基因组大小和分子数目的比例（下表）