非小细胞肺癌骨转移大鼠模型的建立及其肿瘤标志物检测.docVIP

精品论文 参考文献 非小细胞肺癌骨转移大鼠模型的建立及其肿瘤标志物检测 邱勤业　胡汉生　范震波　曾勉东　李远辉　邓星海 广州医科大学附属第三医院　广东　广州　５１０１５０ 资助课题:广东省自然科学基金项目,项目编号:S２０１３０１００１１５３０;文件编号:粤科基办字(２０１３)３号 　　【摘要】　目的　检测血中骨转移相关肿瘤标志物,为肺癌骨转移早期诊断提供理想的动物模型.方法:６周龄雄性SD大鼠２０只,随机分为PBS对照组和观察组,在大鼠左后肢胫骨平台下分别注射PBS溶液和人肺腺癌A５４９细胞.造模后第１５天进行影像学测定并取材,评估骨质缺损程度,HE染色观察肿瘤形态,并通过检验学指标评估骨破坏程度.结果:观察组大鼠体质量逐渐下降,对照组大鼠体重均缓慢增加.２周时观察组大鼠左后肢的活动功能已开始受到影响.显微CT和病理染色显示观察组大鼠胫骨平台破坏严重,呈明显的溶骨性表现,而PBS组大鼠未见骨结构改变.与PBS组相比,观察组大鼠血中BGP、ET－１、PGE２含量明显升高(P＜０．０１),有显著统计学差异.结论:利用人肺腺癌A５４９细胞接种于具有正常免疫功能的SD大鼠体内建立肺癌骨转移模型,同时检测血中BGP、ET－１、PGE２含量变化,为肺癌骨转移早期诊断提供支持. 【关键词】　骨转移瘤;非小细胞肺癌;模型/大鼠;肿瘤标志物【中图分类号】R７３ 【文献标识码】B 　　【文章编号】１００８－６３１５(２０１５)１２－０５９８－０２　　 　　肺癌是目前发病率最高的恶性肿瘤[１－３].骨转移瘤常引起顽固性疼痛、病理性骨折和神经压迫等并发症,严重影响患者的生存和生活质量[４－６].由于肺癌骨转移机制的复杂,临床治疗手段有限疗效不佳动物模型的建立就显得尤为重要.本实验将人肺腺癌A５４９细胞接种于具有正常免疫功能的SD大鼠体内,建立肺癌骨转移模型,同时检测血中骨转移相关肿瘤标志物BGP、ET－１、PGE２,为肺癌骨转移早期诊断提供理想的动物模型. 　　１　材料与方法 　　１．１　主要试剂和材料　本实验使用了人肺癌细胞系,A５４９细胞,购自中国科学院上海细胞库,用含１０％ 胎牛血清的１６４０培养液(含１００U/ml青霉素,１００Lg/ml链霉素)于３７℃、５％CO２及饱和湿度的培养箱中维持培养.实验动物为SPF级SD大鼠３０只,雄性,６周龄,体重２００plusmn;２０g.１．１．２　仪器设备　C０２培养箱为SANYO 产品,型号为MCO－１８AIC;超净工作台由苏州净化设备有限公司生产,型号为SW －CJ－２G;显微镜为UOLYMPS产品,型号BH２;美国ThermoScientificULT－１３８６－３V 超低温冰箱;小动物气体麻醉机为MatrxVMR 型;microCT为瑞士SCANCOmu;CT８０ 型;gamma;放射免疫计数器为安徽中科中佳科学仪器有限公司GC－１２００型等. １．２　方法 　　１．２．１　动物模型建立、分组及给药　取对数生长期的A５４９肺癌细胞,经胰酶消化后,加入不含血清１６４０培养液调整细胞浓度为１times;１０７个/ml.６周龄雄性SD大鼠２０只,随机分为PBS对照组和观察组.大鼠经气体麻醉机麻醉后,取仰卧位固定于操作台上,左后肢褪毛,消毒左侧胫骨上皮肤.将胫骨上段皮肤切开lcm 大小口,分离开肌肉暴露出胫骨骨面,同时避免损伤血管神经.用２０ml注射器针头在胫骨骨面穿刺打孔后,用１０ul微量进样器深刺入骨髓腔, 观察组大鼠缓慢注入２００ul含１０７个A５４９肺癌细胞混悬液,对照组大鼠缓慢注入２００ulPBS溶液,然后迅速用无菌骨腊封住针孔,用生理盐水清洗创口缝合皮肤,创口处做防感染处理.待其苏醒后送回笼中.术后３天每天腹腔注射青霉素１万U/只.每天观察小鼠生存状态及接种部位有无变化. １．３　观察指标１．３．１　一般观察　观察大鼠进食及精神状态,分组前及实验结束前隔２天称重一次. 　　１．３．２　大鼠疼痛行为观察　观察自由行走痛行为评分和丙酮刺激引发缩足反应时间.缩足反应时间的确定[６]:室温保持于(２０＋１)℃,吸取２０ul丙酮,滴于大鼠左侧后肢足掌,记录出现缩足反应的时间,每隔５min进行１次,共５次,取平均值.１．３．３　显微CT摄片　造模１５天后处死,取各组大鼠的左后肢,置于４％的多聚甲醛中,固定７２h.用水冲洗干净,固定于支架上进行microCT图像采集.１．３．４　骨组织病理学观察　造模１５天大鼠处死后将取血后的大鼠左侧后肢剪下,将胫骨分离修剪,保留少许肌肉组织.用１０％中性福尔马林固定１周, 流水冲洗１天,再用１０％硝酸脱钙３天,流水冲洗１天,脱水,石蜡包埋常规切片,片厚４~６um,HE染色,光镜下观察肿瘤生长和骨结构的破坏情况. １．４　肿瘤标志物检测　放射免疫法(RIA)检测大