05-第二章 第四节 聚合酶链式反应及应用 基因克隆课件.pptVIP

第四节 聚合酶链式反应及应用 一、锚定PCR 锚定PCR（anchored PCR）是PCR技术的一种改进，一般的PCR实验中需要知道目的基因两端的序列，而锚定PCR技术不需要。 所谓的“锚定”就是指一端已经定死了，另一端待定（即通过人工合成引物来定），这就为许多我们对不清楚其5’端区域或是3’端区域的RNA的分析找到了一条良好的途径。 1）已知序列3’端区域的扩增 2）已知序列5’端区域的扩增 cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends ,RACE) 当通过RT-PCR得到cDNA片段,利用末端转移酶将oligo(dA)加到cDNA第一链末端，通过另一个特异引物来扩增5’区,这一技术称为RACE。 二、不对称PCR （asymmetric PCR） 三、反向PCR（inverse PCR） 第五节 RAPD技术(Random Amplified Polymorphic DNA) 一、多态性（polymorphism) 1、多态性/差异性的概念 在一个基因座位上有多条等位基因的现象称作遗传多态性（genetic polymorphism）。当多条等位基因在一个种群中稳定存在时，这些等位基因所在的位置被认为是多态性的。如果某条等位基因在种群中存在的概率大于1%，那么就可以认为它是多态的。 2、多态性的种类： 顺序多态性(sequence polymorphisms) 片段长度多态性（length polymorphisms) 3、多态性产生的过程 1）细胞分裂间期 2）减数分裂前期 3）减数分裂中期 4）受精过程 二、RAPD基本原理 三、技术问题1、引物  GGTGTCACTGA中的一个碱基,得到11个引物2、Mg2+浓度要求 四、RAPD技术的应用 1、遗传指纹作图 2、检测遗传多样性与稳定性 ①品种鉴定 ②物种起源与进化 反应组成 模板DNA 缓冲液 Mgcl2 dNTPS 引物 Taq 酶 H2O 20 ul 变性、退火、延伸 第六节 DNA连接酶（ligase） 一、连接酶反应 1、间断修复功能 2、连接功能 —C—C—G—G G—A—T—C—C—C—G—G —G—G—C—C—C—T—A— G G—G—C—C 形成一个相对稳定的短暂结构 —C—C—G—G G—A—T—C—C—C—G—G —G—G—C—C—C—T—A—G G—G—C—C DNA连接酶 —C—C—G—G—G—A—T—C—C—C—G—G —G—G—C—C—C—T—A—G—G—G—C—C 二、E.coli DNA连接酶、 T4DNA连接 酶、RNA连接酶 三、粘性末端连接技术 1、衔接体(linker)技术 2、结合体(adaptor)技术 3、同聚体(homopolymer)加尾技术 T4 DNA Ligase T4DNA ligase repairs breaks in a dsDNA backbone and can covalently rejoin annealed cohesive ends in the reverse of a restriction enzyme reaction,to create new DNA molecules.T4 ligase can even ligate one blunt end to another,albeit with rather lower efficiency. 1、衔接体(linker)技术 2、结合体(adaptor)技术 3、同聚体(homopolymer)加尾技术 第七