溶血与凝聚检查法及异常毒性检查法-程春雷.ppt

溶血与凝聚检查法及异常毒性检查法 程春雷 山东省药品检验所 四. 溶血与凝聚检查法 定义 2010版与2005版区别 修订背景 特殊样品的检查法 四. 溶血与凝聚检查法 定义：本法系将一定量供试品与2%的家兔红细胞混悬液混合，温育一定时间后，观察其对红细胞状态是否产生影响的一种方法。 2010 版与2005版区别 修订背景 1、参考2005年版药典一部“中药注射剂安全性检查法应用指导原则”中“溶血与凝聚检查法”修改而成。 2、考虑一般家兔容易得到，故将羊血删去；采用兔红细胞悬液； 3、2010版用轻轻倒转3次来观察凝聚，规范了操作； 修订背景 4、在显微镜下见红细胞凝集为凝聚，简单明确； 5、同时观察1、2号两个平行管与5号管的对比，来判定是否溶血； 6、考虑药物与一次性试管（高分子材料）的相容性，强调用玻璃试管。 溶血与凝聚的新方法 比色法 红细胞计数与形态观察法 有色供试品溶液溶血检查比色法测定 鼠体内溶血试验研究 比色法 若肉眼观察上清液不能判定是否有溶血发生时，则将各管以每分钟1500转离心10分钟，取上清液在分光光度计上，545nm处进行比色，以0.9%氯化钠溶液为空白读取各管的吸光度值（OD），以下列公式计算溶血百分率： 溶血百分率（％）＝（ODt－ODnc）/(ODpc－ODnc) ×100％ 式中：ODt：供试品溶液管吸光度值； ODnc：阴性对照管吸光度值； ODpc：溶血阳性对照管吸光度值。 若溶血百分率小于5%则表明无溶血发生。 异常毒性检查法 定义：本法系给予小鼠一定剂量的供试品溶液，在规定时间内观察小鼠出现的死亡情况，以判定供试品是否符合规定的一种方法。 异常毒性检查法 异常毒性有别于药物本身所具有的毒性特征，是指由生产过程中引入或其他原因所导致的毒性反应。 供试品如不合格，表明药品中含有超过正常产品毒性的毒性杂质，临床用药将可能增加急性不良反应。 2010 版与2005版区别 * * 0.9%氯化钠溶液或蒸馏水 3、0.9%氯化钠溶液、蒸馏水 取兔或羊血数毫升（约20ml ） 2、取健康家兔血液 2%的兔（或羊）红细胞混悬液 1、2%的家兔红细胞混悬液 2005版 2010版 2005版 2010版 振摇后不分散 6、轻轻倒转3次仍不分散 但1号管和5号管比色无明显著差异 5、但1、2号管和5号管肉眼观察无明显著差异 如试验中的溶液呈澄明红色 4、如试管中的溶液呈澄明红色 2005版 2010版 如有红细胞凝聚的现象，可按下法进一步判定是凝聚还是假凝聚。若凝聚物在试管振荡后又能均匀分散，或将凝聚物置于载玻片上，在盖玻片边缘滴加2滴0.9%氯化钠溶液，置显微镜下观察，凝聚红细胞能被冲散者为假凝聚，若凝聚物不被摇散或在玻片上不被冲散者为凝聚。 7、应进一步置显微镜下观察，如可见红细胞聚集为凝聚。 方法: 2%兔红细胞 37℃水浴3h 被检查物 肉眼观察 优点： 1 、排除纤维蛋白等内源性物质的干扰； 2 、简便、快捷 缺点： 1、肉眼观察:主观性、偶然误差 2、颜色等因素干扰结果的判断 溶血检查试验研究方案1------红细胞计数与形态观察法 肉眼观察 红细胞计数 血液分析仪 血细胞计数板 显微镜下形态观察 数量、形态（皱缩、碎片、边缘轮廓不清晰等） 举例:痰热清注射液溶血实验研究 肉眼观察 Nacl镜下20×10 H2O镜下20×10 痰热清原液镜下20×10 痰热清1:3稀释后镜下20×10 注意事项 * 加样时红细胞尽量混悬均匀（一人搅拌、一个人取样）； * 可疑时，每组增加平行管进行测量，尽量减少误差； * 肉眼观察结束后立即进行计数和显微镜下观察，宜在30分钟之内完成 。 本法系将一定量供试品与2%的兔红细胞混悬液混合，温育一定时间后，测定剩余红细胞人为溶解后上清液的吸光度，结合阴性对照组的吸光度值计算溶血率以判定溶血是否发生的一种方法。 有色供试品溶液溶血检查比色法测定 注意事项 1. 2％的红细胞混悬液尽量配制均匀，最好能计数； 2. 收集剩余红细胞时尽量减少损失，使实验管和对照管保持一致，阴性对照管剩余红细胞溶解后吸光度值理论上应与阳性对照管吸光度值无统计学差异； 3.剩余红细胞溶解完全后再测量吸光度值，若数值过大则应稀释至合适的灵敏度范围供测量； 样品管的吸光度值与生理盐水对照组吸光度值的差值如为负值，则按零计算。