生物仪器分析紫外实验.docVIP

紫外-可见分光光度法的应用 实验目的 1. 掌握紫外-可见分光光度计的原理、基本结构与特点，学会仪器的使用方法； 2. 掌握紫外-可见分光光度计可分析物质的结构特征； 3. 熟悉掌握制作吸收曲线和标准曲线，能正确选择合适的测定波长，并对未知浓度的溶液进行测定； 4. 掌握双波长测定物质的方法； 实验原理 （一）、当光作用在物质上时，一部分被表面反射，一部份被物质吸收。改变入射光的波长时，不同物质对每种波长的光都有对对应的吸收程度（A）或透过程度（T），可以作出这种物质在实验波长范围内的吸收光谱曲线或透过光谱曲线。用紫外-可见分光光度计可以作出材料在紫外光区和可见光区的对紫外光和可见光的吸收光谱曲线或透过光谱曲线。D 与其浓度C 成正比，即D=KC 。 当溶液浓度以百分浓度为单位，且液层厚度为1 cm 时， K 称为该物质的比吸收系数。 （二）、叶绿素的双波长定量测定：是根据叶绿素对某一特定波长的可见光的吸收，用公式计算出叶绿素含量。此法精确度高，还能在未经分离的情况下分别测出叶绿素a 和叶绿素b 的含量。 欲测定叶绿体色素混合提取植中叶绿素a 和叶绿素b 的含量，只需测定该提取物在某一定波长下的光密度D ，并根据叶绿素a 、叶绿素b 在该波长下的吸收系数即可求出叶绿素的浓度。为了排除类胡萝卜素的干扰，所用的单色光应选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。 已知叶绿素a 和叶绿素b 在红光区的最大吸收峰分别位于663nm 和645nm，又知在波长652nm 下，叶绿素a 和叶绿素b 的80% 丙酮溶液的比吸收数分别为82.04 和9.27，而在波长645nm 下，分别为16.75 和45.6。 据此可列出光密度D与浓度（单位mg/l）的下列关系式： D663 =82.04Ca + 9.27Cb (1) D645 = 16.75Ca+ 45.6Cb (2) 解方程式（1)、(2) 得： Ca = 12.7D663 - 2.69D645 (3) Cb =22.9D645-4.68D663 (4) 将Ca 和Cb相加，即得叶绿素总量C T， 即： CT = Ca+ Cb=20.2 D645+8.02D663 (5) 另外，由于叶绿素a、叶绿素b在 652nm 处有相同的比吸收系数(均为34 .5)，也可在此波长下测定一次光密度(D652) 而求出叶绿素a 和叶绿素b 的总量，即 CT= D652×1000/34.5 ?主要仪器设备、材料和试剂 主要仪器： 紫外可见分光光度计、石英比色杯和玻璃比色杯（1cm）一套、移液枪（1~10mL、100~1000uL、20~200uL等）、容量瓶（50ml，1只； 25ml，6只）、烧杯、洗瓶、10ml试管研钵等； 主要试剂： 精确称取 A.R 高锰酸钾 0.5754g，溶于少量 1NH2SO4 溶液中，待全部溶解后，移 入 1000ml 容量瓶中，用 1N H2SO4 稀释至刻度，摇匀。Mn浓度0.2mg/ml ，用时稀释10倍，制成100 mg/ml KMnO4溶液。 80%丙酮，纯净水。 操作方法与实验步骤 （一）、KMnO4溶液标准曲线制作及未知浓度样品的测定： 以母液100 mg/ml KMnO4溶液配制成一系列浓度的标准样品，先确定测定KMnO4溶液的波长，然后制作标准曲线，再根据标准曲线测定未知样品的浓度。 （二）、测定叶绿素含量 1. 称取0.5g菠菜叶片，剪碎置于研钵中，加2ml丙酮研磨成匀浆，定容至25ml,摇匀并放在避光处，取上清液测定。 在可见光区域进行样品的吸收光谱扫描，分析光谱图，确定叶绿素的最大吸收峰； 2. 以80%丙酮溶液作为空白对照，在645、663nm下读取叶绿素的光密度D663、D652，根据公式计算叶绿素含量。 思考题： 1、使用分光光度计时，待测溶液的吸光度数值应控制在什么范围？为什么？如何控制？ 检查紫外-可见分光光度计的性能对测定有什么实际意义？紫外分光光度法哪些影响因素？