膜片钳技术PPT.ppt

;第一部分 膜片钳技术的基本概念 第二部分 离子通道的基本知识 第三部分 全细胞记录结果举例分析;第一部分 膜片钳技术的基本概念;学习内容; 1976年德国马普生物物理化学研究所 Neher和Sakmann首次在青蛙肌细胞上记 录到Ach激活的单通道离子电流，从而产 生了膜片钳技术。 1980年Sigworth等获得10-100GΩ的高阻 封接（Giga-seal）。 1981年Hamill和Neher等对该技术进行了 改进，引进了全细胞记录技术。;膜片钳技术（Patch clamp） 用微玻管电极接触细胞膜，以吉欧姆（GΩ）以上的阻抗使之封接，使电极开口处的细胞膜与其周围膜在电学上绝缘，在此基础上固定电位，对此膜片上离子通道的电流进行监测记录的方法。;;Patch clamp 镜下观;Patch clamp 镜下观;2. 膜片钳的工作原理;电极拉制器 倒置相差显微镜 EPC-10膜片钳放大器 三维微操纵仪 CED 1401数－模/模－数转换器 CED EPC 软件包;电极拉制器： 二步法拉制;倒置相差显微镜;EPC-7膜片钳放大器(德国); 细胞吸附式（Cell-attached mode 或 on cell mode) 内膜向外式(Inside-out mode) 外膜向外式(Outside-out mode) 全细胞记录方式(Whole-cell recording) ;;微电极的拉制;电极液的充灌: 无气泡 充灌玻璃电极长度的1/3;微电极的安装;记录(测量)电极和参考电极： 材料是Ag，表面镀成AgCl 减少接触电位;5. 全细胞记录;电压钳模式：固定电压，记录电流;全细胞记录的操作步骤;全细胞记录的形成过程; 输入漏电流（Input leakage current） 理论上讲，不施加外部命令时，通过放大器探头的电流应该为0，如果由于放大器本身的原因产生了电流，这就是漏电流。由于放大器控制电流漂移的质量很高，一般漏电流都很小。; 封接电流（Seal current） 由于封接质量不高（没有形成良好的高阻封接），从封接处产生的电流。成为噪声。;;Electrode与pipette的区别;命令电压（Command voltage, Vcmp） 通过放大器或计算机发出的指令电压，用于钳制细胞膜电位。 钳制电位（Holding potential, Vh） 人为地将细胞膜内外的电压差固定在某一数值，这一数值即为钳制电压或称钳制电位。实施这一行为的技术为电压钳技术（Voltage clamp）。 ; Rs是指流过电极尖端的电流所遇到的所有电阻。 当将电极放入浴液中或在形成高阻封接时，Rs主要是电极电阻; 全细胞记录模式形成后， Rs包括电极电阻 、破裂膜的残余膜片电阻、细胞内部电阻。;Rs引起的误差有如下二方面： 1. 串联电阻产生电压降，严重影响膜钳制 电压的数值； 2. 膜电位对步阶命令电压的反应时间延迟。;二. 液界（接）电位及其补偿 主要成分： 1. 液体--金属：AgCl电极与电极内液； 2. 电极内液--细胞外液； 3. 电极内液--细胞内液（破膜后，等待一 定时间即可消除）。 范围：可达几百mV 补偿方法：电极入水按“Search”，“Offset”;三. 膜片钳系统中的电容;对于一个球形细胞，膜电容的计算公式为： Cm=πd2 / 100 (pF) d为细胞直径（μm）;电极电容（Pipette capacitance, Cp） 电极电容包括跨壁电容（ Ct ）、电极非浸 液部分与邻近地表形成的漂浮电容（Cs）。; 跨壁电容（Transmural capacitance, Ct） 电极浸液部分的内外液之间形成的电容，跨壁电容的介质为玻璃电极壁。 在膜片钳实验中其值可能很大，一般电极浸液深1mm会产生1pF或更大一些的电容。;减小跨壁电容的方法： 1. 加厚电极管壁：采用厚壁玻璃毛坯拉制电极，或在电极浸液部分外部涂以硅胶树脂等疏水性物质。 2. 减小电极浸液深度：浸液部分越大，Ct越大。 3. 补偿电路：采用膜片钳放大器内置的电容补偿电路进行补偿。; 慢电容（Slow