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一，分组 实验对象：A549细胞 干预措施：含有0、000ug/ml茶氨酸的细胞培养液000ug/ml茶氨酸 二，实验试剂 5X电泳缓冲液 tris 15.1g, glycine 94g, SDS 5.0g,加入800ml，搅拌溶解。加将溶液定容至1L后，室温保存。用的时候稀释成1*的就可以了。 缓冲液 tris 24.2g, NaCl 80g 。加将溶液定容至1L后，室温保存。用的时候稀释成1*的就可以了。 5XX转膜缓冲液配制： 200mL转膜缓冲液母液（5X）+200mL 甲醇＋600mL 5X加样缓冲液: mol/L Tris缓冲液ml，甘油4ml，SDS ，巯基乙醇l，溴酚蓝，H2O混匀备用。按1:比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮min混匀后再上样 mol/L Tris缓冲液: Tris，H2Omol/L Tris缓冲液: Tris，H2OH2O定容至100ml. 10% AP : AP0.1g , H2O定容至1ml. 10%下层胶 : H2O 5.9ml 30%丙烯酰胺 5ml 1.5 mol/L Tris缓冲液H2O 4ml 30%丙烯酰胺 1ml 1.5 mol/L Tris缓冲液取1.2ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(30mg BSA)中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶 液。配制后可立即使用，也可以-20℃长期保存。2. 取适量25mg/ml蛋白标准，稀释至终浓度为0.5mg/ml。例如取20μl 25mg/ml蛋白标准，加入980μl稀 释液即可配制成0.5mg/ml蛋白标准。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简 便起见，也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。稀释后的0.5mg/ml蛋白标准也可以-20℃长期保存。3. 根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。例如5ml BCA试剂A加100μlBCA试剂B，混匀，配制成5.1ml BCA工作液。 BCA工作液室温24小时内稳定。 将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20μl加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μl。5. 加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20μl。6. 各孔加入200μl BCA工作液,37℃放置20-30分钟。 注:也可以室温放置2小时，或60℃放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，颜色会随着时间的延长不断加 深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或适当延长孵育时间。7. 测定A562，540-595nm之间的波长也可接受。根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度 5 免疫反应 1、封闭：将膜用移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭2h。 2、 一抗 （1）封闭结束后，从封闭液中取出膜，1X TBST 10min X 3次; （2）将一抗用封闭液稀释至适当浓度，将膜蛋白面朝上放于槽中，加入抗体，室温下孵育1-2h后，4度冷库过夜， 次日用1X TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次10min。 3、二抗 准备二抗稀释液，并与膜接触，室温下孵育1h后，用1X TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次10min。 6 显影