人胆酸转运蛋白基因的克隆、亚细胞定位及其在肾组织中的表达.pdfVIP

维普资讯 中国病理生理杂志 ChineseJournalofPathophysiology 2008，24(2)：335—339 · 335 · [文章编号] 1000—4718(2008)02—0335—05 人胆酸转运蛋 白基因的克隆、亚细胞 定位及其在肾组织中的表达 白雪源 ， 马玉香 ， 罗成华 ， 师锁柱 ， 侯 剀 ， 冯 哲 ， 傅 博 ， 陈香美 (解放军总医院’全军肾脏病研究所暨肾病重点实验室，普外科，北京 100853； 青海大学附属医院肾内科，青海 西宁810001) [摘 要] 目的：克隆人肾与小肠 ASBT(顶端Na／胆汁酸协同转运蛋白)基因并比较2者的序列差别，明确 ASBT蛋白在肾小管上皮的亚细胞定位及在人肾组织中的表达情况。方法：从人肾和小肠组织中提取总RNA，然 后用带有8肽FLAG标签的PCR引物通过RT—PCR技术扩增ASBT全长cDNA基因并测序，并将其插入真核表达 载体中构建ASBT蛋白真核表达载体 ，然后将其转染到肾小管上皮细胞 LLC—PKI中表达并用免疫荧光一激光共 聚焦显微镜观察该蛋白的亚细胞定位情况。用免疫组化技术观察ASBT在人肾组织中的表达分布。结果：序列分 析结果表明肾小管ASBT基因的序列与小肠ASBT序列完全～致。Westernblotting表明ASBT基因在LLC—PKI细 胞中得到了正确的表达。共聚焦显微镜分析显示正常ASBT蛋白主要定位于肾小管上皮细胞膜上，与生物信息学 的预测结果一致。免疫组化染色表明ASBT蛋白主要表达于人近端肾小管上皮的刷状缘侧，在间质及远端小管没 有表达。结论：人肾小管ASBT基因序列与小肠 ASBT相同，ASBT蛋白主要表达于近端肾小管上皮细胞管腔侧细 胞膜。 [关键词] 胆汁酸类；肾小管；亚细胞定位；载体蛋白质类 [中图分类号] 0493．8，Q735 [文献标识码] A Genecloning，subcellularlocalization andexpression in kidneytissueof humanASBT protein BAIXue—yuan ，MA Yu—xiang。，LUO Cheng—hua ，SHISuo—zhu ，HOU Kai， FENG Zhe ．FU Bo ．CHEN Xiang—mel (ChinesePLAInstituteofNephrology，DepartmentofGeneralSurgery，ChinesePLAGeneralHospitalMilitaryPostgrad- uateMedicalCollege，Beijing100853，China；DepartmentofNephrology，TheAffiliatedHospitalofQinghaiUniversity， Xining810001，China．E—mail：xmchen@publci．bto．net．ca) [ABSTRACT] AIM：TocomparethecDNAsequencesofASBT(apicalNa ／bileacidcotransporter)genecloned from humankidneyna dintestinetissues，nadtodeterminesubcellularlocalizationofASBTinrenal tubularepithelial cells andexpressionsiteofASBTinhumna kidneytissue．METHODS：Thetotal RNA wasextractedfrom humna kidneyandin— testinetissues．Thefull—lengthcDNA geneof ASBTwas amplifiedbyRT—PCR techniqueusingprimerswith8一peptide FAL G tag，sequencednadinsertedintoeukaryoticexpressionvectortoconstru