活性氧在乳香挥发油抑制结肠癌细胞增殖中的作用.docVIP

精品论文 参考文献 活性氧在乳香挥发油抑制结肠癌细胞增殖中的作用 郝雪微1 阮 莹2 刘欣宇1 顾园竹1 李金桐1 　　（1哈尔滨医科大学大庆校区医学检验与技术学院 黑龙江 大庆 163000） 　　（2哈尔滨医科大学药学院 黑龙江 大庆 163319） 　　【摘 要】目的：研究活性氧在乳香挥发油抑制结肠癌细胞增殖中的作用。方法：用MTT法检测乳香挥发油对结肠癌细胞SW480的抑制率，用流式细胞术检测细胞内ROS含量及细胞的凋亡率。 结果：乳香挥发油对结肠癌细胞有抑制作用，同时使细胞内ROS含量增加，凋亡率增加，加入GSH后可以减少ROS含量，减少凋亡率。结论：乳香挥发油可以抑制结肠癌细胞的增殖及诱导凋亡，GSH可以通过减少活性氧含量减少细胞凋亡。 　　【关键词】乳香挥发油；人结肠癌细胞SW480；活性氧；凋亡 　　【中图分类号】R34 【文献标识码】B 【文章编号】1003-5028（2015）5-0235-02 　　1 实验材料 　　药品与试剂：乳香挥发油为课题组之前制备[2]，成分大多为单萜、倍半萜、醇及酯类等，其中含量最高的成分为乙酸辛酯、橙花叔醇异丁酯、3,7,11-三甲基-1,6,10-十二碳三烯-3-醇甲酸酯及beta;-榄香烯，含量分别为34.660%、18.290%、9.612%和5.614%。左旋谷胱甘肽(L-Glutathione, GSH)购于Sigma公司。MTT，活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)检测试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购于碧云天生物技术公司。 　　细胞及培养：人结肠癌细胞SW480细胞为本室保存, 接种在含10%胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100mu;g /ml链霉素的RPMI-1640培养液中，在37℃，5%的C02环境下培养。 　　2 实验方法 　　2.1 MTT测定细胞的增殖活性 　　取对数生长期的SW480细胞，以1times;105个/ml接种于96孔板(100mu;l/孔)，培养过夜后，加入不同浓度的乳香挥发油及活性氧清除剂(GSH),实验分组为：Control、EOF低剂量(20mu;g/ml)、EOF高剂量(40mu;g/ml)、GSH(10mu;g/ml)、EOF低剂量(20mu;g/ml)+GSH(10mu;g/ml) 、EOF高剂量(40mu;g/ml)+GSH(10mu;g/ml)；复设3孔。药物作用12小时，弃培养基，向每孔分别加入20mu;l的5mg/ml的MTT存储液，并于37℃孵育4小时。之后向每孔加入150mu;l的DMSO, 酶标仪570nm波长处测定吸光度值A。按以下公式计算抑制率(IR):IR=(1-实验组平均吸光度A值/对照组平均吸光度A值)times;100%。 　　2.2 检测ROS的生成量 　　取对数生长期的SW480细胞，接种于6孔板培养皿中。按 2.1中分6组，12小时后离心收集细胞，并用200mu;l的RPMI1640培养液制成单细胞悬液。然后加入10mu;l ROS探针于37℃孵育45分钟，最后用PBS缓冲液清洗以出去未结合探针。用BD FACs Aria Ⅰ型流式细胞仪通过荧光密度来检测ROS的含量。GSH于乳香挥发油作用前1小时进行预处理。 　　2.3 通过Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率 　　将肿瘤细胞按照1times;105/ml的浓度接种到6孔板中，培养12 h后按以上分组计量加药，每个药物浓度设置3个平行孔。药物作用12h后用预冷的PBS清洗细胞两次，用结合液重悬细胞并加入Annexin V-FITC避光孵育10 min，离心沉淀细胞后用结合液重悬，并加入PI冰上避光孵育5min,用流式细胞仪检测细胞凋亡率。 　　2.4 统计学方法 　　所有实验结果均是以3次独立实验数据分析所得。采用SPSS13.0统计学软件进行t检验及方差分析。 　　3 结果 　　3.1 乳香挥发油对SW480细胞的增殖抑制 　　结果表明乳香挥发油对细胞抑制呈剂量依赖性(图1)，分别使用浓度的20mu;g/ml和40mu;g/ml的挥发油作用12h后抑制率分别为(22.8plusmn;3.1)%和(46.1plusmn;4.7)。在使用活性氧清除剂GSH后，抑制率减少到(18.7plusmn;2.5)%和(41.4plusmn;5.4)%。 　　图1 乳香挥发油及GSH对细胞的抑制作用 　　（vs Control: **Plt;0.01, *Plt;0.05; vs EOF(L): △Plt;0.05; vs EOF(L)+GSH: ▲▲Plt;0.01 ） 　　3.2 乳香挥发油诱导凋亡与ROS的生