第十章DNA序列分析的原理与应用-中南大学网络教学平台.docVIP

中南大学生物科学与技术学院 分子生物学研究中心 教 案 授课科目: 医学分子生物学授课内容: 基因结构与表达分析的基本策略 授课对象：临床医学七年制、八年制 授课时数：6 学时授课教师：授课地点：湘雅医学院新教学区 授课时间： 授课教材：医学分子生物学（21世纪高等院校教材），胡维新主编，北京：科学出版社，2007年2月，第一版； 医学分子生物学（卫生部8年制规划教材），冯作化主编，北京： 人民卫生出版社，2005，第一版 第七章 基因结构与表达分析的基本策略 一、目的要求： 掌握：DNA双脱氧末端终止法测序、Southern blot杂交、Northern blot杂交和PCR等技术原理及在因结构与表达分析中的应用； 熟悉：Western blot 原理及在特定基因产物-蛋白质分析中的应用。 了解：DNA序列测定的原理及其主要应用；RNA酶保护试验原理及应用；原位杂交技术；DNA微阵列技术原理；流式细胞术的应用；免疫组化方法的应用。 二、讲授重点：Southern 杂交和PCR等技术原理及应用；Northern blot、RT-PCR和Real-time PCR技术原理及应用；Western blot 原理及应用。 三、讲授难点： RNA酶保护试验原理及应用。 四、教学方法：多媒体教学 五、教 具：多媒体课件 六、讲授内容： 第一节 DNA序列分析 一、双脱氧末端终止法（讲授重点与难点） （一）基本原理 1977年，Sanger建立的双脱氧核苷酸末端终止法以DNA合成反应为基础 图7-1 ATP、dATP和ddATP的结构示意图 图7-2 DNA合成反应模式图 末端终止法：在DNA合成反应体系中，除含有正常脱氧核苷三磷酸底物外，还加入少量的双脱氧核苷三磷酸(ddNTPs)特殊底物，由于这种底物的5′-磷酸基团是正常的，能够替代相对应的脱氧核苷三磷酸而与引物延伸链的3′羟基连接，进入部分新合成链；但由于这种特殊底物不存在3′羟基末端，故下一个核苷酸底物不能通过5′-磷酸基团与之形成3′,5′-磷酸二酯键，从而导致DNA新链的延伸提前终止于这一“异常”核苷酸处，而掺入的双脱氧核苷三磷酸则位于DNA延伸链的最末端（图7-3） 然而 图7-3 末端终止部位示意图 （二）主要步骤 1.单链DNA模板的制备。 2.DNA模板与测序引物退火。 3.掺入法标记反应。 4.延伸-终止反应。 图7-4 测序反应的基本原理和过程 5．变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。 6. 放射自显影。 7.阅读测序结果。 图7-5 末端终止测序反应产物电泳区带放射自显影 二、化学降解法（自学为主） 化学降解法是建立在对原有DNA的化学降解过程基础之上的。 （一）基本原理 在化学降解法中，单侧末端标记的DNA片段在5组相互独立的化学反应中分别得到部分降解，其中每一组反应特异地针对某一种或某一类被修饰碱基，因此形成5组带有放射性标记的长短不一的DNA混合物。它们的长度取决于该组反应所针对的碱基在原有DNA片段上的位置。然后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分别分离这5组DNA混合物，再通过放射自显影来检测末端标记DNA链的电泳区带位置。 （二）主要步骤 1.目的DNA的制备。 2.单侧末端标记待测DNA片段。 3. 碱基的特异性修饰及化学降解。 图7-6 化学降解G反应模式图 4.聚丙烯酰胺凝胶电泳。 5.阅读分析结果。 图7-7 化学降解反应产物电泳区带放射自显影示意图 三、DNA序列分析的自动化（主要了解原理） 采用4种带有不同琥珀酰荧光素标记的终止物ddNTPs，可以在同一个反应管中进行末端终止测序反应，并于变性聚丙烯酰胺凝胶的同一泳道中进行电泳检测，从而降低了测序泳道间迁移率差异对精确性的影响。同时，对DNA序列的识读也在电泳过程中完成，即当带有某种荧光素标记的单链DNA片段电泳到激光探头的检测范围时，激光所激发的荧光信号被探测器接收，经计算机分析数据，于记录纸上以红、黑、蓝和绿四种颜色打印出由带有不同荧光素染料标记终止物ddNTPs标示的DNA片段峰谱，继而自动排出DNA序列。 图7-8 荧光偶联法自动DNA测序结果 第二节 核酸分子杂交技术 1969年，Pardue等首先建立了细胞原位杂交技术。 1975年，Southern EM建立了检测DNA的Southern印迹杂交技术。 1977年, Stark GR建立了检测mRNA的Northern印迹杂交技术。 一、核酸分子杂交的原理 核酸分子杂交实质上是双链DNA或者具有二级结构的RNA变性后，其具有互补序列的两条单链的复性过程。 1. 变性（denaturation） 2. 复性(renaturation) 3. 杂交（hybridization