博士学位论文--肾脏D 型氨基酸氧化酶活性与D-消基精氨酸手性转化的关系.pdfVIP

上海交通大学博士学位论文 第 四 章 肾脏D型氨基酸氧化酶活性与D-硝基精氨酸手性转化的关系 前期研究表明 D- 硝基精氨酸 NG -nitro-D-arginine, D-NNA 在体内可发生手 性转化 生成L 型对映异构体 Wang et al., 1999 L-硝基精氨酸 NG -nitro-L-arginine, L-NNA 作为一氧化氮合酶抑制剂 可减少一氧化氮生成 升高实验动物血压(Palamer et al., 1988; Rees et al., 1990) 但体内D-NNA 手性转化的分子机制尚不明确 我们 的前期试验证实 D-NNA 的手性转化主要集中在肾脏(Cheng et al., 1997; Wang et al., 1999) 同时资料表明D-氨基酸氧化酶 D-amino acid oxidase, DAAO, EC 1.4.3.3 作为在自然界广泛存在的一种核黄素酶 在哺乳动物体内主要分布于肾脏 并可催 化D-氨基酸生成相应的á-酮酸 (Pilone, 2000) 因此我们推测D-NNA 手性转化通路为 首先D-NNA 在DAAO 作用下生成相 应的 á-酮酸 随后 á-酮酸在特定的转氨酶作用下生成L-NNA 如图 1 所示 由于 高等生命体内只合成L 型氨基酸 所以á-酮酸在转氨酶作用下只能生成L 型氨基酸 这也解释了D-NNA 的单向手性转化现象 因此本实验目的在于考察DAAO 在D-NNA 手性转化中的作用 为此试验将考 察DAAO 抑制剂苯甲酸钠对D-NNA 所至大鼠升压反应的影响 同时对体内各组织 匀浆的DAAO 活性和D-NNA 减少量与L-NNA 生成量三者之间的相关性进行研究 并利用纯的DAAO 蛋白 研究DAAO 对D-NNA 催化活性 并初步探索了D 型氨 基酸手性转化的选择性 - 50 - D-硝基精氨酸体内手性转化机制的研究 图1体内D-NNA到L-NNA手性转化的假设通路 Fig 1 The proposed pathway of two-step conversion of D-NNA to L-NNA 1 材料和方法 1.1 药物和主要试剂 D-NNA D-亮氨酸 D- Leu D- 丙氨酸 D-Ala D-苯丙氨酸 D-Phe 和 G D- 精氨酸 D-Arg 吉尔生化上海有限公司 上海) D- 硝基精氨酸甲酯(N - monomethyl-L- arginine, D-NAME) Bachem, 美国 L-NNA和天门冬氨酰苯丙氨 酸甲酯(aspartame) (Acros, 比利时) 猪肾(pk)DAAO Sigma 美国 其余试剂均 为国产优质纯 1.2 仪器与设备 RM6420 四道生理仪 成都仪器厂 毛细管电色谱仪 (Capillary Electrochromatography CEC) 美国通微分析技术有限公司 C18反相毛细管柱 75 - 51 - 上海交通大学博士学位论文 ìm I.D. × 25 cm 上海通微分析技术有限公司) GENE SAPCE 分光光度计 (HITACHI 日本) Thermomixer Compact (Eppendorf公司 美国). 1.3 动物 SD大鼠 250 350 g 购自中国科学院动物中心 1.4 DAAO抑制剂苯甲酸钠对D-NNA升压作用的影响 SD大鼠给予戊巴