实验四 感受态细胞的制备.ppt

Company LOGO 《分子生物学实验》 实验四、大肠杆菌感受态细胞的制备 分子生物学实验 实验四　大肠杆菌感受态细胞的制备 实验结果与讨论 实验步骤 实验仪器与试剂 实验原理 实验目的 分子生物学实验 实验目的 1、掌握大肠杆菌感受态细胞的制备原理。 2、学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的方法和技术。 分子生物学实验 实验原理 　1、感受态细胞制备原理：受体细胞经过一些特殊方法(如电击法、CaCl2、RbCl等化学试剂法)处理后，细菌会膨胀成球形，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。 （Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域） 分子生物学实验 2、感受态转化原理：细菌处于0℃的CaCl2低渗溶液中，细胞膜的通透性发生变化，同时转化混合物中的质粒DNA会形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经过42℃短时间的热激处理，促进感受态细胞吸收DNA复合物，在培养液中生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，在选择培养基上可获得所需的转化子。 抗Amp 宿主细菌 含Amp培养基 实验仪器 超净工作台 离心设备 台式高速冷冻离心机 制冰机 分子生物学实验 实验试剂 1、实验材料：E. coli JM109。 2、实验试剂： LB液体培养基：称取胰蛋白胨10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 10 g，加双蒸水至总体积1L，高压下蒸气灭菌。 (2) 0.1mol/L CaCl2溶液：称取1.1098g CaCl2(无水,分析纯)，溶于90mL重蒸水中，定容至100mL，高压灭菌。 (3) 30%甘油：量取30mL甘油，加入70 mL双蒸水， 混匀，定容至100mL ，高压灭菌。 分子生物学实验 实验步骤 菌体的培养(事先已做) 受体菌的培养从 LB平板上挑取新活化的E. coli JM109单菌落，接种于3～5 mL LB液体培养基中，37℃下振荡培养 12 hr 左右，直至对数生长后期。 将该菌悬液以 1: 100～1: 50 的比例接种于50mL LB液体培养基中，37℃振荡培养2～3 hr，至OD600为0.3～0.4。 分子生物学实验 取2个1.5mL离心管，分别转入1mL菌液，4℃ 12000 rpm，离心2 min。 弃去上清，每管加入1mL预冷的 0.1 mol/L CaCl2 溶液，悬浮细胞，冰上放置 30 min。 4℃ ，12000 rpm，离心2 min。 弃去上清，每管加入50μL预冷的0.1 mol/LCaCl2 溶液，轻缓悬浮细胞,50μL预冷的30%甘油，冰上放置5 min，即为感受态细胞悬液。 将感受态细胞悬液，放置于-80℃，可保存半年。 2. 感受态细胞的制备 (CaCl2 法，超净台内) 分子生物学实验 第二天， CaCl2 法 前一天晚上， 第二天早上 菌体的 活化 感受态 的制备 分子生物学实验 每人2管感受态细胞 结果 分子生物学实验 注意事项 细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从-80℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。 细胞生长密度以刚进入对数生长期时为宜，可通过监测培养液的OD600来控制。JM109菌株的OD600为0.3－0.4密度比较合适，密度过高或不足均会影响转化效率。 实验操作时要格外小心，悬浮细胞时要轻柔，以免造成菌体破裂，影响转化。 实验过程中要注意无菌操作，以免染菌，并且整个实验过程都需置于冰上。 分子生物学实验 思考题 1. 在制备感受态细胞的实验中要注意哪些细节？ * 元素符号:Rb中文名称:铷 * 细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收 Company LOGO * 元素符号:Rb中文名称:铷 * 细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收