两大实验：质粒DNA 提取,质粒转化和筛选.pptVIP

DNA重组技术DNA recombination technology 基本策略 实验一 碱裂解法小量提取质粒 DNA 质粒 (plasmid) 定义：是存在于细菌染色体外的双链环状DNA。具有可自主复制、传给子代、也可丢失及在细菌之间转移等特性，与细菌的遗传变异有关。 作用：携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，在基因克隆、表达中具有重要作用。 碱裂解法提取质粒DNA实验原理 实验二 一、原理 细菌处于0 ℃，在CaCl2低渗溶液（0.1M）中，菌体细胞膨胀成球形，DNA则与CaCl2形成抗Dnase的羟基－磷酸钙复合物粘附于细胞表面，经42 ℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，重组子的基因在被转化的细菌中得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。 原理 1. 氯化钙（二价钙离子）的作用：提高细胞壁（膜）的通透性； 2. 热激后迅速转移到冰上：促使质粒DNA转移进入胞内； 3. 这种转化方法适用于双链环状DNA（质粒），线型DNA不能采用此法。（在自然界自然发生的转化过程中，进入细菌细胞中的为单链DNA。） 二、材料与仪器 体外重组质粒 CaCl2法制备的感受态细胞（Competent cells） 水浴锅 培养基LB 移液器 摇床 冰盒（制冰机） 感受态细胞及特点 感受态是指细胞处于最适于摄取和容忍外来DNA的生理状态。感受态细胞特点为： 感受态细胞及特点 受体细胞的修饰酶活性最高，而限制酶活性最低，使转入的DNA分子不易被切除或破坏。 受体细胞本身处于非生长繁殖阶段（即受体细胞染色体相对稳定）。 不存在载体的筛选基因，多采用限制酶阴性、修饰酶阳性的大肠杆菌作为受体细胞。 三、方法 1. 将大肠杆菌DH5α 在 LB 平板上划线，37 ℃培养16~20hr（或过夜） 2. 从平板上挑取一个2~3 mm大小的单菌落移至2~5 ml LB液体培养基中，37 ℃ 强烈振荡过夜 3. 取1个三角瓶将菌液按1︰100稀释接种，37 ℃强烈振荡培养3 hr，此时细菌OD600= 0.2~0.4,为对数生长期或对数生长期前期 4. 将培养物置冰上10 min 后转移置离心管中, 4000 rpm, 4 ℃离心 5 min 5. 弃上清，加入10 ml ( 50 ml 原培养物)冰浴冷的0.1M CaCl2溶液,致敏悬浮细胞，置于冰上10 min 6. 4000 rpm, 4℃离心 5 min 回收细胞，弃上清，每50ml 原培养物再加入2 ml 冰冷的0.1 M CaCl2溶液，悬浮细胞 7. 按每份200ul分装细胞，若不24小时内进行转化,可在感受态细胞中加入终浓度为10%的灭菌甘油,置于-70 ℃冰箱保存。 加10 μl 含40 ng 的DNA溶液至200 μl 感受态细胞中，温和混匀，置于冰上30 min 42 ℃热冲击90s，迅速放回冰上，将细胞冷却1~2 min，加入500 μl LB（或者SOC）培养基。 将转化后细菌放置37 ℃，200 rpm 振荡培养45 min，让细菌中的质粒表达抗生素抗性蛋白。 取200 μl 转化混合物铺于LB+Amp（含有诱导物 IPTG 及生色底物 X-gal）平板上，室温放置至液体被琼脂全部吸收，倒置平板于37℃培养12~16 h(过夜) 取出平板，观察平板上菌落的颜色和形状，挑选白色克隆进行PCR和质粒酶切验证。 蓝白筛选筛选的原理 3. 这些载体包括M13噬菌体，pUC质粒系列，pEGM质粒系列等。 抗生素、诱导剂浓度 Amp——终浓度为100μg/ml IPTG——终浓度为0.5~1.0mmol/L X-Gal——终浓度为80μg/ml 目的基因的获取 质粒的提取制备 重组子（杂化DNA） 体外重组（连接） 转化 感受态细胞 筛选阳性转化子 获得子代重组DNA 筛选 扩增 在碱性环境中，细菌膜破裂释放内容物。染色体DNA变性分开，而质粒DNA虽变性但仍处于缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，最后用酚、氯仿抽提纯化得到质粒DNA。 1.细菌的培养 2.细菌的收集和裂解 3.质粒DNA的分离和纯化 4.质粒的鉴定 碱裂解法提取质粒DNA主要步骤 取单克隆细菌至培养液中，37℃、200 rpm 摇床培养过夜。 取1.5 ml过夜培养菌液放于EP管中，12 000 r/min离心30s，弃去上清液。