色谱柱技术8F.ppt

液相色谱柱的选择和维护 1, 液相色谱柱的选择 2, 液相色谱柱的使用与维护 (2) 从样品的基本类型出发,可以将样品归入几大类： 合成高分子: 合成高分子 高分子复合物 大分子(M ? 10K) 生物高分子: 蛋白质 核酸 糖及糖缀合物 多肽 有机化合物 药物 其它 小分子(M? 10K) 天然产物 无机离子 (3) 合成高分子的分离 ? 分子量大、且分布不均匀 ? 最有效的色谱分离方法是排阻色谱（SEC） 通常称之为GPC。 ? 注意使柱子的分子量范围，即孔径与待分离 高分子相配。 ? 通常选用交联聚苯乙烯凝胶柱子，硅胶基质 柱亦可应用。 ? 选择合适的计算机软件，以便可与其它分子 量测定法，如粘度法相比对。 ? 使用聚苯乙烯标样以标定流出曲线。 (4) 合成高分子复合物分析 ? 这里的复合物指添加有各种添加剂或助剂的 高分子制品。 ? 添加剂和助剂通常为小分子，其总含量低于 主体（基质）高分子材料，但种类繁多，一 般的分离程序多采用样品预处理法将基质与 助剂分离，但复杂体系分离困难。 ? 推荐以排阻色谱法将基质高分子与助剂分离； 助剂再以正相色谱或反相色谱分离,然后再以 结构测定方法定性(MS、LC－MS、NMS等) (5) 蛋白质分离、分析 ? 可选用的色谱模式有SEC（此处亦称GFC）、离子 交换、疏水相互作用和反相色谱。特殊情况下选 用亲和色谱。 ? 所有分离蛋白质的色谱柱填料都必须是大孔或无 孔的。 ? 从复杂体系中分离出目的蛋白往往需将几种方法 联合使用。 ? 多数情况下，多步骤分离过程的第一步和最后一 步多采用GFC。第一步为粗分离，最后一步为脱 盐。 ? 灵活运用离子交换色谱，有时可以事半功倍。 ? 疏水作用色谱有利于保护乃至提高活性回收 率；但高盐浓度往往造成设备的腐蚀和环境 问题。 ? 反相色谱为迫不得已时所用。其缺点是成本 高、产品易失活及溶剂造成环境问题。 ? 亲和色谱具最高的选择性，最适于固定的单 一品种产物的分离与纯化。 ? 使用反相色谱时，以碳链短的填料较为适宜。 (6) 核酸分析 ? 核酸分析时，优先选择无孔型填料 ? 寡核苷酸分析时，既可选用多孔型填料， 也可选用无孔型填料。通常，链长在 200bps以上时，亦选用无孔型。 ? 核酸分析时首选粒径2－4?、无孔的DEAE型 或季胺盐型离子交换填料 ? 合成的寡核苷酸一般链长较短，可采用多 孔型填料 ? 未脱保护基的寡核苷酸可以用反相色谱法 分析，离子交换色谱亦可应用。 (7) 糖及糖缀合物 ? 有些寡糖分子量很小，为方便起见一并在 一起讨论 ? 对糖类的分析可采用亲水相互作用色谱、 SEC、反相色谱和高pH值离子交换色谱 ? 高分子量的糖及糖缀合物宜选用 SEC 分离 ? 高pH下的离子交换结合脉冲安培法检测， 可获得高分辨率和高灵敏度。 ? 如不需要分辨率，则首选亲水相互作用色 谱。（氨丙基键合相、高CH3CN含量水溶液 为流动相）保留值虽水增多而下降。 ? 新出现的高聚物型氨基柱亦可使用。 ? 反相色谱分离糖时，往往使用水为流动相， 与通常的RP柱相反。残留有较多硅醇基或金 属离子的柱子有时可获得较好效果。 ? 如前所述，石墨化碳柱有可能在糖分离上发 挥优势。 (8) 多肽分离分析 ? 首选的方法是反相色谱 ? 标准方法是以0.1%TFA-H2O-CH3CN为流动 相进行梯度淋洗 ? 如使用高分子型反相柱,则可以用HCl取 代TFA，HCl的紫外吸收小是其一大优点。 ? 强亲水性肽的分离可使用石墨化碳填料柱。 (9) 其它小分子有