仪分实验-荧光法测定维生素B2药物中核黄素含量.pptVIP

* 实验报告格式 1、实验目的（简单） 2、实验原理（详细） 3、试剂仪器（简单） 4、实验步骤（简单） 5、数据处理（详细，表格，图） 6、结果讨论（重点） ①、回答思考题的问题 ②、讨论引入误差的原因 ③、实验操作中的注意事项及减小误差的方法 荧光法测定维生素B2药物中核黄素含量 实验二 维生素B2 * 维生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。稀释后有强烈荧光，维生素B2溶液在430～440 nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，其峰值波长为525 nm。 一、实验原理 * （1）定量依据：维生素B2在水中是强的荧光物质，并且在低浓度时，荧光强度与维生素B2浓度呈正比： If = kc （2）定量方法（标准曲线法）： 测定一系列已如浓度的维生素B2的荧光强度，然后以荧光强度对维生素B2浓度作标准曲线，再测定未知浓度维生素B2的荧光强度，把它代入标准曲线方程求出其浓度。 If = kc 荧光强度 vs.浓度标准曲线 荧光强度 核黄素浓度 样本 二、实验仪器 * 测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。 特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 三、实验步骤及注意事项 吸量管的使用，溶液转移，定容 同样条件下测定读取荧光数据 荧光仪的操作，发射光谱 和激发光谱绘制 If对浓度C拟合标准曲线 4.数据处理 2.标准溶液荧光测定 3.未知样品荧光测定 1.配制标准溶液 移液管的使用 常见移液管：标有温度和容量(注意是否标有吹) 用途：准确移取一定体积的液体 操作：洗涤(蒸馏水)、润洗(3次)、移液、洗涤干净 注意事项：1、整个操作过程中，保持移液管的垂直；2、读数时视线与凹液面平齐 溶液下端1-2cm 1. 打开氙灯，再打开主机，然后打开计算机启动工作站并初始化仪器。 2. 仪器初始化完毕后，在工作界面上选择测量项目，设置适当的仪器参数：确定激发波长和发射波长。 3. 样品测定。 4. 退出主程序，关闭计算机，先关主机，最后关氙灯。 基本操作 四、数据处理 * 浓度（10-1 μg.mL-1） 0 1 2 3 4 5 X 荧光强度 扣除空白 1.原始数据 2.标准曲线的绘制和未知样品的浓度计算 五、实验注意事项 1.实验过程中，注意使用石英比色池时必须保持四面干净，拿稳棱角注意不要摔落; 2.实验完毕，注意检查仪器是否运行正常，关闭程序是否正确。 3.试剂取后，得放回原处，保持试验台整洁。 * 1.为什么荧光光度法较吸收光度法灵敏度高？ 2.维生素B2在pH = 6~7时荧光最强，本实验为何在酸性溶液中测定？ 3.如何绘制激发光谱和荧光发射光谱？ 4.哪些因素可能影响维生素B2的荧光强度？ * 六、实验思考题 Π电子共轭体系 （1）灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级；为什么？ 检测下限：0.1～0.1?g/cm-3 相对灵敏度：0.05mol/L 奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。 （2）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱； （3）试样量少 缺点：应用范围小。 * 07/16/96 * ## A. 光源： 为高压汞蒸气灯或氙弧灯，后者能发射出强度较大的连续光谱，且在300nm～400nm 范围内强度几乎相等，故较常用。 B．激发单色器：置于光源和样品室之间的为激发单色器或第一单色器，筛选出特定的波长激发光。 C．发射单色器：置于样品室和检测器之间的为发射单色器或第二单色器，常采用光栅为单色器。筛选出特定的波长发射光。 D． 样品室：通常由石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样品)组成。测量液体时，光源与检测器成直角安排；测量固体时，光源与检测器成锐角安排。 E． 检测器：一般用光电管或光电倍增管作检测器。可将光信号放大并转为电信号。 * 07/16/96 * ## * 07/16/96 * ## Π电子共轭体系 （1）灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级；为什么？ 检测下限：0.1～0.1?g/cm-3 相对灵敏度：0.05mol/L 奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。 （2）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱； （3）试样量少 缺点：应用范围小。 * 07/16/96 * ## A. 光源： 为高压汞蒸气灯或氙弧灯，后者能发射出强度较大的连续光谱，且在300nm～400nm 范围内强度几乎相等，故较常用。 B．激发单色器：置于光源和样