乳液 PCR 法扩增复杂基因序列方法的建立.ppt

3 BSA对乳液PCR扩增产物的影响 BSA作为Taq 酶的稳定剂在乳液PCR中起到了保护和帮助DNA聚合酶反应的作用，当没有BSA加入时，只有少量或没有扩增产物出现，分析原因可能是在油相中存在一些未知的大分子蛋白，这些蛋白在DNA聚合酶作用是会抑制或停止其催化作用导致只有少量或没有扩增产物出现 BSA对DNA扩增影响示意图 TAQ酶 未知杂蛋白 无BSA 有BSA BSA 4 乙醚对破乳过程的影响 无水乙醚是有节制的溶于水中（6.9g /100ml），若破乳时采用无水乙醚则会吸取样品水相中的水，导致水相减少甚至没有水相。 5 PCR反应体系温度对扩增产物的影响 琼脂糖凝胶电泳显示不同温度条件下（10oC，15oC ，20oC，25oC，30oC）的乳液PCR扩增产物含量不同,在25oC条件下，乳液PCR获得了较好的扩增效果，由此可以看出温度对乳液PCR扩增产物的含量具有非常重要的影响 小结 4 比较成功的解决了普通PCR方法在一定条件下特异性差的瓶颈问题，为后续实验提供了可靠的数据保证 目的 方法 步骤 结果 分析 应用 发展 1 通过乳液PCR方法与普通PCR方法的比较，建立了乳液PCR法扩增复杂基因序列的方法 2 讨论了乳液PCR法油相的制备方法，水相的配比，破乳的过程以及不同水油比例对扩增产物的影响 3 研究发现当加入100g/L的BSA时，水油体积比在1：2.5时，破乳水饱和乙醚体积比为1：1时，水油相混合在5min,1700rpm条件下得到了最佳的扩增效果 致谢 对于本论文的完成，我非常感谢我的指导老师张红琳老师对于我的悉心指导，感谢各位答辩老师的中肯点评，同时也要特别感谢谈冰畅,周围等同学给予我的大力支持和帮助，衷心的感谢大家。 谢谢！ 乳液 PCR 法扩增复杂基因序列方法的建立 生物化工与环境工程学院 学生：徐敏轩 指导教师：张红琳 周东蕊 研究背景、目的与意义 目的 建立乳液PCR(ePCR)方法,解决普通PCR（cPCR）方法的瓶颈问题 乳液PCR 普通PCR 背景 PCR技术作为一种特异性DNA体外扩增技术，具有实践证明了的诸多优点，但普通PCR在一定方面存在偏向性，实验方法依然有待进一步完善 意义 通过建立乳液PCR(ePCR)方法解决普通PCR存在的问题，为体外扩增特异性DNA提供了新的实验方案，弥补了国内空白 普通 PCR 方法的优越性与局限性 cPCR 操作 简便 快速 用时少 经济 价格低廉 样本DNA 数量少 灵敏 度高 重复 性好 特异 性强 样品处理简单 乳液 PCR 方法与普通 PCR 方法的基本原理比较 Droplets in Oil ePCR AP Oil AP Oil T Min cPCR Oil Oil Oil 3步PCR Oil 仪器与试剂 磁棒(3×8mm) 旋涡振荡器(1700rpm) 低温冷冻管(1.8 ml) 主要仪器 凝胶成像系统Syngene GS-800灰度扫描仪 水平电泳仪PAC3000 主要试剂 乙醚（水饱和） 小牛血清白蛋白(BSA) Mineral oil Tween 80 Span 80 人工乳酸菌质粒 Forward primer Reverse primer Triton X-100 Oil PCR buffer dNTPs DNA polymerase Mg2+ ddWater cPCR ePCR 实验方法与步骤 乳液PCR油相制备 乳液PCR和普通PCR水相制备 乳液制备 PCR扩增 水饱和乙醚制备 破乳 扩增产物检测 实验 准备 部分 实验 实施 部分 样品配比 1 2 7 3 4 6 5 实验结果 1 乳液PCR油相制备 50ml离心管，在25oC条件下表1配制（2份油相） 移取750μl油相 375μl 375μl 1700rpm持续搅拌 2 乳液PCR和普通PCR水相制备 1.5ml离心管，25oC条件下表2配制 （每个样品3个平行+1空白） 3 乳液 PCR 乳液制备 OIL 50ml 乳液PCR AP 300ul 750ul 375ul 375ul 150ul(含BSA) 150ul(不含BSA) 水油体积比 1：2.5 含BSA乳液 不含BSA乳液 水相逐滴加入 2min内加完1700rpm，5min 样品配比 普通PCR AP 150ul 空白50ul ePCR 乳液（不含BSA） 150ul ePCR 乳液（含BSA）150ul 按每管50ul