R-133a真核表达载体的构建及转染大鼠心肌H9C2细胞.docVIP

miR-133a真核表达载体的构建及转染大鼠心肌H9C2细胞 第21卷第1期 2011年1月 江苏大学(医学版) JournalofJiangsuUniversity(MedicineEdition) Vo1.21No.1 Jan.2011 miR一133a真核表达载体的构建及转染大鼠心肌H9C2细胞 张洪涛,张赢予,周艳芳,王好,郑枫,张国辉 (江苏大学1.临床医学院,江苏镇江212001;2.附属人民医院心内科,江苏镇江212002) [摘要]目的:构建miR一133a真核表达载体后,体外转染大鼠H9C2心肌细胞.方法:设计并合成DNA模板引 物,用T4DNA连接酶将pre—miR一133a连接到线性化的PgenesIL一1.1质粒中,对重组质粒进行酶切及测序鉴定.以Li— pofeetamine2000Reagent将鉴定正确的重组质粒瞬时转染H9C2细胞,用流式细胞仪及倒置荧光显微镜检测转染效 率.结果:miR一133a真核表达载体符合设计要求,瞬时转染H9C2细胞的转染率达70%以上.结论:成功构建了 miR一133a真核表达载体并转染至大鼠心肌H9C2细胞. [关键词]miR一133a;真核表达载体;凋亡;转染 [中图分类号]R34[文献标志码]A[文章编号]1671—7783(2011)0l一0026—03 ConstructionofmiR一133aeukaryoticexpressionvectorand transfectionintoH9C2cell ZHANGHong—tao,ZHANGYing—yu. , ZHOUYah-fang,WANGHao,ZHENGFeng,ZHANGGuo.hui. (1.SchoolofClinicalMedicine,JiangsuUniversity,ZhenjiangJiangsu212001;2.DepartmentotCardiology,theAffiliatedPeoplesHospitalof JiangsuUniversity,ZhenjiangJiangsu212002,China) [Abstract]Oective:ToconstructmiR一133aeukaryoticexpressionvectorandtransfectitintoH9C2 cel1.Methods:DesignandsynthetizethePCRtempla—primer.Ligatethepre-miR一133awithlinearized PgenesIL一1.1byT4DNALigase.Therecombinantswereidentifiedbyendonucleasedigestionandse- quenced.TransienttransfecttheperfectrecombinantsintoH9C2cellsbyLipofectamine2000Reagent.Fi— nally,detecttransfectionefficiencybyflowcytometerandinvertfluorescencemicroscope.Results:The miR一133aeukaryoticexpressionvectorswereconsistentwiththedesignandthetransfectionefficiencyof H9C2cellswas70%.Conclusion:miR一133aeukaryoticexpressionvectorwassuccessfullyconstructed andtransfectedintoH9C2cel1. [Keywords]miR一133a;eukaryotieexpressionvector;apoptosis;transfection MicroRNAs是一类大小约18～24个碱基保守 的内源性非编码RNAs,由具有发夹结构的长约70 ～ 90个碱基的单链RNA前体经过Dicer酶加工后 生成.通过与靶mRNA特异性碱基互补配对,引起 靶mRNA降解或抑制其翻译,从而参与基因表达调 控.miRNA一133家族由miRNA-133a-1,miRNA- 133a一2及miRNA一133b组成,分别与miR.1—1,miR一 1—2和miR-206作为双顺反子转录本转录.miR一 133a一1和miR一133a-2有相同的序列,与miR一133b 在3端有2个核苷酸不同.miR.1-2/miR一133a一1和 miR一1—1/miR一133a一2基因在心肌和骨骼肌中特异性 表达,而miR-206/miR一133b基因仅在骨骼肌中表 达.本实验拟以大鼠心肌细胞系H9C2细胞为研 究对象,转染构建