微矩阵法.docVIP

微矩阵上的分子相互作用 Edwin Southern, Kalim Mir Mikhail Shchepinov 章承芝译　　　 固体支持物上的核苷酸探针的结构特征以及它们与溶液中目标分子相互作用的分子基础都可以用杂交过程来解释。我们讨论寡核苷酸矩阵是如何成为大规模研究这些相互作用的强大工具的，因为运用传统的分析手段进行这种研究是不可能的。　　　 DNA微矩阵是一系列利用DNA双螺旋优势特征--双链互补--的技术中必威体育精装版的一个。这种拥有高度复杂结构的分子最显著的特征在于两条链分开后可以精确的重新结合。早期对于变性和复性的研究表明，DNA溶液的Tm值取决于G+C的含量和盐浓度，复性的速率依赖于序列的复杂性。固体支持物的引入大大扩大了这个方法应用的范围，开创了基于矩阵的方法。这个方法源于发现单链DNA能够与硝酸纤维膜牢固结合，从而防止DNA链与链之间的结合，但允许与互补的RNA杂交。这个简单的方法使研究者获得了大量基础性的数据。比如，它被用于测量诸如真核生物中核糖体RNA和tRNA等重复基因的拷贝数，检测在放大等过程中多个拷贝中的变化。另外，在获得DNA克隆之前，进行密度梯度离心时有助于核糖体RNA基因的纯化。克隆获得后，还可帮助研究者找到包含特定序列的克隆。这是印迹方法的直接起源。第一个印迹方法就是用滤膜杂交并结合限制性切割后的凝胶电泳的。与微矩阵更相关的方法是斑点印迹法。斑点印迹法的自动化和小型化显示了如何大规模应用分子杂交开发从基因组项目中获得的数据。　　 斑点印迹法和DNA微矩阵的主要区别在于是否应用无渗透、刚性的支持物例如玻璃就是其中之一。这类支持物比多孔膜和凝胶具有很多实际的优势。因为液体不能渗透支持物的表面，目标核苷酸就不会扩散到孔里，而可以立刻与探针结合，这大大提高了杂交的速率。尽管就算用不渗透的支持物，混合对于达到杂交的最大速率也很重要。　　 杂交后清洗的步骤同样不受扩散的影响，因而加速了进程，提高了重复使用性。玻璃支持物的平滑、坚硬和透明有助于图像的获得和处理，因为探针的位置可以比在小的柔软的膜上更容易确定。高精度图像对微型化很关键，而微矩阵能做到。物理刚性使流动的细胞能够结合，从而实现高通量分析所必须的自动化处理。这些实际的优越性被应用于每一种矩阵，包括克隆的DNA、PCR产物以及合成的寡核苷酸。用不渗透的支持物制造的矩阵从理论上更能被接受：因为此时，由于溶剂和溶质扩散出或入孔以及目标进入孔时发生的多重相互作用，再不会使分子相互作用的动力学复杂化。另外，能够很好的确定短探针的依附处。基于以上原因，我们将不详细讨论探针和支持物非共价结合的矩阵以及用多孔支持物制造的矩阵，尽管它们也有许多用途。我们集中研究寡核苷酸一端与非渗透性支持物共价结合的矩阵。　　 目前，微矩阵主要的大规模应用是相对表达分析。另一个应用是在基因组规模上分析DNA的变异，其前景正在日益呈现。这两个应用有许多相同的要求，但在一些重要的方面不同。对DNA变异分析来说，最重要的是通过探针和目标的相互反应能够区别出仅仅一个错配的碱基对。只有短探针才能达到如此高的分辨率。而对检测表达水平来说，序列的分辨就不是非常重要了，这时在广泛的动力学范围内，定量测量就很重要。其它的应用还包括分子相互作用的描述和有效反义试剂的发现。　 矩阵制作 　　 矩阵制备有两种方法：（1）原位合成，（2）预先合成寡聚核甘酸后附着。二者相比，前者有如下优点：产量高，在支持物表面也比较稳定。这提供了组合的策略：制造大的寡核苷酸矩阵可以用很少的耦合步骤。对于原位合成，有三种方法可用于将寡核苷酸直接合成到矩阵支持物的确定位置上。光化学去保护方法由Robert Lipshutz和同事在文中阐释。用喷墨法将核苷酸前体传递到支持物表面的方法已经被一些公司开发了，但还没有商业化的产品。这两种方法可以制造随意的芯片，就是说，寡核苷酸可以在任何位置组成任何序列。合成也可以通过物理性的限制使其定位。比如，用掩蔽物或物理的屏障。通过这种方法，包含许多不同的、相关的序列的复杂矩阵可以通过组合方法用耦合步骤制备。通过垂直的交叉的通道覆盖前体，以制备所有序列长度确定的芯片：圆形的或钻石形的反应腔通过将前体置于支持物表面一系列覆盖的区域，用以制作扫描或砖瓦途径的矩阵。这些矩阵对研究杂交行为很有帮助。　　 评价在表面的寡核苷酸的质量很困难。材料的量--最密集的堆积为约10pmol每平方毫米--非常小。用可剪切的接头分析寡核苷酸显示其质量很高。借鉴材料科学的方法，非破坏的测量方法可以用椭圆计或干涉计进行。这些技术可以用于常规质量控制，但是还不能用于大多数生物实验室。另一方面，预先合成的寡核苷酸可以在它们连接到表面上之前测定，但是从经济方面考虑目前这个方法还不适于制作大的矩阵。当需要大量相同探针的矩阵