实验室常用技术参数资料2.docVIP

杂交试验中用于降低背景的封闭剂 试剂 用途 Denhardt试剂 Northern杂交 使用RNA探针的杂交 单拷贝序列的Southern杂交 将DNA固定于尼龙膜上的杂交 Denhardt试剂通常配制50×贮存液，过滤后保存于-20℃。可将该贮存液10倍稀释于预杂交液（常为含有0.5%SDS和100μg/ml经变性被打断的鲑精DNA的6×SSC或6×SSPE）中。50×Denhardt液中含5g聚蔗糖（Ficoll,400型，Pharmacia）、5g聚乙烯吡咯烷酮和5g牛血清白蛋白（组分V”Sigmal），加水至终体积为500ml。 BLOTTO Grunstein-Hogness杂交 Benton-Davis杂交 除单拷贝序列Southern杂交以外的所有Southern杂交 斑点印迹 1×BLOTT（牛乳转移技术优化液，Bovine Lacto Transfer Technique Optimizer）,是含5%胶脂奶粉和0.02%叠氮钠的水溶液，应保存于4℃。使用前可用预杂交液稀释25倍。BLOTTO不应与高浓度的SDS并用，因为后者会导致牛奶中蛋白质析出。如果杂交背景不合要求，可在杂交液中加入NP-40至终浓度为1%。BLOTTO不能用作Northern杂交的封闭剂，因为这一封闭剂中可能含有RNA酶，其活性之高使人无法接受。 注意：叠氮钠有毒性，取用时需戴手套小心操作。含叠氮钠的溶液应予明确标记。 肝素 Southern杂交 原位杂交 肝素（Sigma H-7005，从猪中提取的二级产品或相当等级的产品）用4×SSPE或4×SSC溶解配制成50mg/ml的浓度，保存于4℃。肝素在含有葡聚糖硫酸酯的杂交液中用作封闭剂的浓度为500μg/ml，在不含葡聚糖硫酸酯的杂交液中的浓度为50μg/ml。 经变性并被打断的鲑精DNA southern和Northern杂交 把鲑鱼精子DNA（Sigma,Ⅲ,盐钠）溶解于水配制成10mg/ml的浓度，必要时于室温磁力搅拌2～4h助溶。把溶液中NaCl的浓度调至0.1mol/L，并用酚和酚/氯仿各抽提一次，回收水相。合DNA溶液快速通17号皮下注射针头12次，以剪切DNA。加入2倍体积用冰预冷的乙醇沉淀DNA。离心回收DNA并重溶于水，配制成10mg/ml的浓度，测定溶液的OD260值并计算出精确的DNA浓度，然后煮沸10min，分装成小份保存于-20℃。使用前置沸水浴中加热5min，然后迅速在冰浴中骤冷。预杂交液中应含有100μg/ml经变性并被打断的鲑鱼精子DNA 　　六、常用凝胶的技术参数 　　1．葡聚糖凝胶的某些技术数据 种类 干颗粒直径（μ） 分子量分级范围 床体积毫升/克干分子筛 得水值 溶胀最少平衡时间（h） 柱头压力（kPa）(2.5cm直径柱) 肽及球形蛋白质 葡聚糖（线性分子） 室温 沸水浴 Sephadex G-10 40～ 120 ～700 ～700 2～ 3 1.0±0.1 3 1 　 Sephadex G-10 40～ 120 ～1500 1500 2.5～3.5 1.5±3.5 3 1 　 Sephadex G-25 　 　 　 　 　 　 　 　 粗级 100～300 　　(≈5～100目) 　 　 　 　 　 　 　 中级 50～150 　　(≈100～200目) 1,000～5,000 100～5,000 4～6 1.5±0.2 6 2 细级 20～800(≈200～400目) 　 　 　 　 　 　 　 超细 10～40 　 　 　 　 　 　 　 Sephadex G-50 　 　 　 　 　 　 　 　 粗级 100～200 　 　 　 　 　 　 　 中级 50～150 1,500～ 500～ 　 　 　 　 　 细级 20～80 30,000 10,000 9～11 5.0±0.3 6 2 超细 10～40 　 　 　 　 　 　 　 Sephadex G-75 　 　 　 　 　 　 　 　 　 40～120 3,000～ 1,000～ 　 　 　 　 　 超细 10～40 70,000 950,000 12～15 7.5±0.5 24 3 3.92～15.86 Sephadex G-100 　 　 　 　 　 　 　 　 　 40～120 4,000～ 1,000～ 　 　 　 　 　 超细 10～40 1,500,000 150,000 15～20 10.0±1.0 48 5 2.35～9.41 Sephadex G-150 　 　 　 　 　 　 　 　 　 40～120 5,