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基于 Gibson Assembly 的无缝克隆快速设计教程 软件：Genome Compiler 设计举例：把 LacZ 克隆到pEGFP-N3 中，得pLacZ-EGFP 难点：LacZ 需要和 EGFP 融合表达，所以克隆位点的选择尤其关键！ 注：Snapgene也可以设计，容后开篇介绍。 1、下载pEGFP-N3 的载体文件。我们推荐从 Snapgen 网站下载。导入到Genome compiler 中（如图 1 ）。LacZ 序列软件本身就有，可以有哪些信誉好的足球投注网站得到。 图 1 2、点击 File-new construction project, 再点击下面的 Gibson Assembly 进入（图 2 ）。 图2 3、把 Backbone pEGFP-N3 拖入，载体信息会完全展示出来，包括序列、图谱和各种注 释（图 3-4 ）。点击sequence 和 circular 可以在质粒的序列和图谱之间切换，方便查 看。图 4 所示的是我们选中对多克隆位点 MCS 的序列展示。 图3 图4 1.图 4 之间有一些选项：快速克隆首先需要对载体进行线性化处理。通常有 2 种方法： 双酶切线性化和 PCR 线性化。本次教程我们来讲双酶切线性化。 2.本例是做融合蛋白的克隆构建，所以必须考虑读码框的问题。简而言之，就是要融合 表达的两个蛋白之间间隔的碱基数必需是 3 的倍数，比如9bp ，15bp ，21 bp 这样子，而且 不能含有终止密码子 Stop Codon-TAA ，TAG 和 TGA。 3.鉴于此，我们选择双酶切的时候一定要足够小心，确保满足第 6 条的标准。比如在本 例中我们选择 NheI 和 BamHI(如图 5) ，BamHI 识别序列为 GGATCC 6 碱基限制性内切酶， 编码两个氨基酸 G 和 S ，因此，可以作为读码框的一部分。而BamHI 识别位点 GGATCC 距 离下游 GFP 的举例为 15bp ，刚好包含5 个氨基酸 GSIAT （如图15 ）。如果不能完美对框， 比如距离为 14bp ，则需要在引物合成的时候补上1 个（非终止密码子）碱基，如果是 13bp ， 则需要补 2 个（非终止密码子）碱基等。 图5 4、然后我们选中NheI ，会自动出来下面的选项，酶切位点的处理方式，包括不处理Non processed （不处理），regenerate （再生）和 Eliminate（去除）。我们选择regenerate（再 生），这样保证构建的克隆酶切位点可以恢复（图 6 ）。同样的，下游的酶切位点也同样 处理。然后点击下一步。 图6 5、这一步是选择 insert （插入片段 ）。我们选择”Add fragment“ （图7 ）。把 LacZ 文件拖 进去（图 8 ）.中间可以对插入片段重命名，位置也可以自由定制（本例中选择的时 候注意不要带 Stop Codon ）。本例LacZ 序列不带 stop condon ，我们选择select all 即可。如果是做多片段组装，方法同上。需要对齐读码框的请一定格外小心。点击 下一步。 图7 图 8 6、这一步就进入引物设计设计阶段。默认重叠序列 15-25 bp ，TM 值在 50 度（图 9 ）。 点击 run assembly。引物序列就设计好了（图 10 ）.但我们不着急，继续下一步。 图9 图 10 7、下一步就把克隆虚拟组装好了（图 11 ）。但我们一定要 check 一下读码框是否和我 们预想的一样正确。我们