稳定细胞株.docxVIP

让你一步了解构建稳定细胞株先了解一下背景外源基因在细胞中的表达可分为两大类。瞬时表达 瞬时表达外源DNA不整合到宿主染色体中，虽然可以达到高水平表达，但通常只持续几天。瞬时表达所需的人力和时间比稳定表达少，但因为DNA摄入率和表达水平在不同实验中差异较大，不长久也不稳定。二、稳定表达 稳定表达外源DNA整合到宿主细胞染色体上，或者相当于附加子可持续存在，可使宿主细胞长期表达目的基因。然而，外源基因整合进宿主染色体上的几率很小，通常发生随机整合，其表达水平和整合位置有关，会受周围染色体元件的影响。 因此，要获得高产的稳定表达细胞株往往需要进行大量的筛选。好在，还有给力的筛选系统可供选择。G418 筛选系统G418 筛选系统是稳定表达细胞株最常见的筛选系统。G418是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过影响核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核等细胞都有毒性，包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞，也包括原生动物和蠕虫。当载体上的neo基因被整合进真核细胞基因组合适位置后，则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA，从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。neo基因为非扩增性选择基因，不影响目的基因拷贝数。G418筛选系统已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用，与之作用原理相似的还有潮霉素和嘌呤霉素筛选系统。而在生物医药领域中主要是利用CHO细胞的GS或DHFR?筛选系统进行抗体药物、重组蛋白等的生产。CHO表达系统CHO表达系统是目前应用最广泛的真核表达系统之一，与其他表达系统相比，它具有许多优点：表达产物胞外分泌，便于分离纯化；具有重组基因的高效扩增和表达能力；CHO细胞属于成纤维细胞，很少分泌内源蛋白，利于外源蛋白的分离纯化；准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近天然蛋白分子；贴壁生长，有较高的剪切力和渗透压耐受能力，可进行悬浮培养或在无血清培养基中达到高密度，培养体积能达到100 L以上。改造 CHO细胞可更好地表达外源蛋白，外源基因在CHO细胞中扩增是提高表达水平的重要策略之一。DHFR基因扩增系统DHFR基因扩增系统最常用，当携带DHFR基因的表达质粒转染CHO细胞后，或携带DHFR基因的标志质粒与携带外源基因的表达质粒共转染CHO-DHFR-细胞后，可以得到在选择培养基生长的细胞克隆，DHFR可被叶酸类似物氨甲喋呤（Amethopterin，MTX）所抑制，不断提高MTX浓度，绝大多数细胞死亡，但在极少数幸存下来的抗性细胞中，DHFR基因均得以扩增。进行性选择抗氨甲喋呤的细胞系，结果会导致与DHFR串联在一起的外源基因的共扩增，拷贝数可增加几百到几千倍，从而使目的基因高水平表达，抵消氨甲喋呤的抑制效应。更重要的是，扩增的区域远远大于DHFR基因本身，即与DHFR基因相邻的DNA区域同时被扩增。但是，它却有以下缺陷。表达细胞仅限DHFR缺陷型细胞，重复筛选抗性细胞费时费力，去除选择压力后，扩增基因不稳定。细胞遗传学表明，在选择压力下，扩增基因的大小和结构处在不断变化之中。在细胞分裂的不同时间，不同的宿主细胞和选择药物使基因的扩增范围处于不断变化之中，从100～1000kb不等。即使是同一种细胞，选择过程不同，基因扩增的范围也不同。然而，出现了更有效的扩增系统—GS扩增系统，GS（谷氨酰胺合成酶）扩增系统是新近发展的更有效的系统，具有更高的扩增效率。谷氨酰胺合成酶在ATP水解提供能量时，利用细胞内的氨和谷氨酸合成谷氨酰胺，在缺乏细胞外谷氨酰胺的培养条件下，加入谷氨酰胺合成酶抑制剂甲硫氨酸亚砜（MSX）,可使GS?基因及与之相连的目的基因扩增，达到提高目的基因表达水平的目的，由于只有多拷贝的GS?编码基因才能抗MSX, 所以在转染过程中不必使用GS?缺陷型的受体细胞，而且在正常MSX 浓度下就能筛选到含高拷贝外源基因的转染细胞，这是GS系统比DHFR 系统优越之处，主要哺乳动物细胞株为CHO-K1细胞。加压扩增外源基因表达，除了单纯使用DHFR扩增系统或GS扩增系统外，也可采用G418与MTX联合作用细胞，G418与MSX（methioninesulphoximine，GS抑制物）联合作用细胞，或者利用DHFR扩增系统与GS扩增系统共加压。Flp-In系统产生背景 随着新技术的不断革新，针对真核质粒转染构建稳定表达细胞株的方法也不断地创新，出现了TALEN、IOS、Cas9和Flp-In等技术，不断地提高稳定表达细胞株构建的成功率。Flp-In系统以其独特的优势，广泛应用于构建过表达或静默特定基因的稳定表达细胞株，用于特定基因的功能研究。Flp-In系统依据酿酒酵母