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细胞水平研究克隆动物异常发育原因 　　摘要：克隆动物的研究在异种器官移植、抗病育种和乳腺生物反应器等方面具有广泛的应用前景， 但目前的克隆动物的效率很低，只有不到10%的胚胎能发育到个体，而且这些个体中多有异常发育的现象。本文主要对导致克隆动物异常发育的原因在细胞水平作了较为全面的分析。 关键词：克隆 核移植 异常发育 中图分类号：Q132 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2013）14-0036-03 1997年2月27日，英国《自然》杂志公布了一项爱丁堡罗斯林研究所威尔莫特等人的研究成果：经历了247次失败之后，终于在1996年他们得到了一只克隆雌性小绵羊，取名“多利”。自从多利产生国内外生物科学工作者在克隆动物技术上取得了显著的成绩。在畜牧业中，克隆动物具有提高动物生产性能、繁育优良品种、改善畜产品质量等优势；在医药方面，克隆动物在研究人类疾病模型、异种器官移植和生产生物医药产品方面都显示出了巨大的研究潜力。但是目前生产的克隆动物普遍出现死亡率高，个体发育不正常的现象。通过研究发现这一现象与许多细胞因素有关，包括：核供体的重编程、卵母细胞的成熟发育、X染色体活性和基因表达、线粒体的变化、细胞因子的效应等。 1 核供体重编程和卵母细胞成熟 核移植一大目的就是获得多产的后代，但是要成功的获得后代还需要许多事件能够正常发生。首先就是核供体需处在一种能够被重塑，基因组能够被逐渐的重编程的状态；其次就是受体卵母细胞必须成熟，能够启动重组胚的发育；再者，就是体外培养体系必须适应这种胚胎的生长需求。代孕动物的生理状态对核移植后代的成功繁育也有着十分重要的影响，例如，处于排卵前或是排卵后的状态，不同的季节等对应的胚胎的妊娠率和分娩率都有所不同。 核移植过程中，目前不仅囊胚发育率和妊娠率较低，而且产生的后代个体也多有异常问题而出现新生胎儿出生不久就死亡的现象。主要表现在胎儿个头大，心脏肥大、卵圆孔闭合不全、瓣膜发育不全，肝脏肿大和充血、肝组织发育不全、脂肪沉积严重，肺不能正常充气、形态畸形，脾脏较小、出血，肾脏不成形、伴有大量脂肪沉积，脑组织发育不全、含量少，等。1-7究其原因，除了上面提到的，估计得追溯到表观修饰异常和发育相关基因表达异常等细胞内深入的活动机制上来。8-10 2 X染色体 由于剂量补偿效应，哺乳动物的雌性胚胎中的一条X染色体会发生失活。Xist基因的表达决定了这一效应的发生，而且Xist在二细胞时期就开始表达。其表达还引起了子代细胞中X染色体复制不同步，特别是在胚胎致密化之后，这种不同步X复制的细胞比例逐渐增加。 体外生产的胚胎在培养过程中，雄性胚的生长状况要优于雌性胚，特别是在培养液中含有高浓度的葡萄糖、血清以及相对较高的温度都会给雌性胚的生长带来不利影响。这种发育的二态现象，很可能是由于培养环境引起了基因的差异表达。但让人迷惑的是，有一研究发现，有384个基因在正常胚与体外形成胚里表达有差异，其中85%基因在IVP胚胎中表达下调；而与X染色体相关的基因表达却上调11，而且这一情况在雄性胚和雌性胚中相同。Xist与二态现象之间究竟有什么样的关系人需要进一步探索。 在研究X相关基因在存活和死亡克隆牛中的表达时，发现很多基因出现异常表达。有意思的是，Xist基因在雄性克隆牛的组织中呈高度甲基化，而在雌性克隆牛组织内Xist普遍处于低甲基化水平，而且出生后死亡的克隆牛比围产期死亡的还要低。这与核重编程不完全有很大的关系，而且与X染色体选择性随机失活受到干扰有关。尽管Xist基因的甲基化和Xist的转录都有是组织差异的，但是Xist基因DNA甲基化程度高的样品的Xist转录水平也高，这似乎暗示着还存在其他因素在调控Xist转录上起着更大的作用。总之，X染色体的剂量效应及其印记修饰状况与胚胎的正常发育有着重要的作用。 3 线粒体 线粒体在机体里发挥重要作用，它不仅给细胞直接提供能量，而且能维持细胞稳态，介导了信号转导和凋亡等生理活动。线粒体在细胞内的数量，形态和分布状态都影响着细胞的生理功能。线粒体内部基因功能不全，其分离、融合等过程都受到核基因的协作。在成熟的卵母细胞中线粒体的拷贝数约为105个，当其受精后，胚胎发育到囊胚的这段时期，线粒体都不重新合成，都是使用卵母细胞遗传而来的线粒体。近来，研究发现含有高拷贝线粒体的卵母细胞其受精率更高，而且对胚胎发育更有利。Wai等发现含有4000个拷贝的线粒体能够发育到胚胎附植前，而要能够完成完成附植后发育线粒体的数量至少要40000-50000个12。对附植前的胚胎进行研究，发现体外培养条件能引起胚胎内线粒体过早的开始复制，线粒体的形态与定位模式也有所改变。但是目前线粒体影响细胞功能的详细机理还不太清