《分子遗传学》第八章.pptVIP

（2）杆状病毒的表达特点 ①感染后36-48h，病毒开始合成大量的 多角蛋白。 ②多角蛋白的启动子特别强。 ③多角蛋白基因可以被替换掉而不影响 病毒的繁殖。 多角体基因被外源基因取代后，病毒仍然能形成有感染能力的病毒粒子，但不能形成多面体。 3. 转化子筛选 通过显微镜检查看是否有多面体形成。 源自草地夜蛾的细胞株，在这种细胞中，多角蛋白的启动子特别活跃。 2. 最普遍应用的宿主细胞株 （1）转移载体的构建 大肠杆菌质粒，插入两段AcMNPV序列以供同源重组。 4. 杆状病毒转化载体 杆状病毒的基因组太大（13kb环状DNA），不能直接插入。 必须使用同源重组的办法。 多角蛋白的启动子和终止子及polyA加尾信号。 启动子与终止子之间插入多克隆位点 转移载体 （2）杆状病毒载体转化过程 ① 转移载体中插入外源基因 ② 转移载体与野生型AcMNPV DNA共同转染宿主细胞 ③ 转移载体与病毒基因组发生双交换 ④ 外源基因被交换转入病毒基因组中 ⑤ 重组病毒侵染宿主4-5天后即可收获重组蛋白。 4.目前已经用杆状病毒在真核生物细胞中表达的外源蛋白 组织型纤溶酶原激活剂 Simian rotavirus外壳蛋白抗原 狂犬病病毒糖蛋白 类狂犬病病毒蛋白 脊髓灰质炎病毒蛋白 鼠单克隆抗体 Lassa virus蛋白 白细胞介素2 流感病毒凝集素 HIV-1外壳蛋白 红细胞生成素 Blue tongue virus中和抗原 β干扰素 β淀粉酶前体蛋白 腺苷酸脱氢酶 α干扰素 外源蛋白 外源蛋白 5. 杆状病毒大规模表达存在的问题 杆状病毒侵染昆虫幼虫，在幼虫体内表达外源蛋白，成为“低成本蛋白工厂”。 22只粉蚊夜蛾幼虫4天后表达的人腺苷酸脱氢酶占幼虫总蛋白的2%-5%。共产出9mg很纯的产物。 （1）寿命短 感染4-5天后宿主细胞裂解或幼虫死亡。 （2）共同转染率低 重组率更低。0.1%-1%。 6. 构建可持续表达的载体 利用AcMNPV的一个早期基因IE1的启动子。 IE1基因的转录不依赖于病毒的其他基因产物，而且在昆虫细胞中表达正常。 把外源基因插入到IE1启动子和IE1终止子之间。构成整合型载体。 载体转染宿主细胞后随即整合到宿主染色体上，实现外源蛋白的持续表达。 载体 IE1启动子 外源基因 IE1终止子 载体 （1）O-糖基化（Ser, Thr） 增加蛋白质的稳定性和某些特殊性质。 3. 蛋白质糖基化 糖基 （2）N-糖基化（Asn） Dol：长醇 Mannose：甘露糖 Glucose：葡萄糖 N-AcGlc：N乙酰氨基葡萄糖 磷酸化、乙酰化、硫酸化、丙烯酸化、羰基化、豆冠酸化、软脂化 4. 氨基酸残基的修饰 羟脯氨酸 甲基组氨酸 羟赖氨酸 羧基谷氨酸 缺乏蛋白质的加工。 （如糖基化、氨基酸修饰等）。 十、原核细胞表达的缺陷 酵母菌、植物原生质体、动物培养细胞等。 第二节 外源基因在真核细胞中的表达 真核或病毒启动子 MCS PolyA信号 终止子 外源基因 ① 能在E.coli中克隆和扩增。 1. 酵母克隆载体 一、在酵母中表达 Leu2+、His+、Ura3+、Trp1+; ④ 有合适的克隆位点。 ③ 有酵母的选择标记 Ori ②有大肠杆菌的选择标记 Ampr、Tetr。 Dividing Saccharomyces cerevisiae (baker’s yeast) cells 由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片断（选择标记）构成。 ColE1 酵母Leu 2+ 如 PYeleu10: （1）整合型载体(YIp) ①转化率低（1-10转化子/微克DNA）。 特点： 载体上只有细菌的复制区，没有酵母的自主复制区。 可与受体细胞的染色体DNA同源重组，随染色体一起复制。 ②不能在酵母细胞中自主复制 ③整合到酵母的染色体上 ④不能从酵母细胞中提取载体。 由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片断(选择标记和酵母DNA自主复制顺序ARS）构成。 大肠杆菌质粒 酵母ARS （2）复制型载体(YRp) 酵母选择标记 ARS ARS（automously replicating sequence）: ATTTTATATTTA T G T 250bp 保守区 特点： ①转化率高（102-103转化子/微克DNA) 。 ④不稳定，容易丢失。 ②可从大肠杆菌和酵母中提取质粒。 既能在大肠杆菌中复制，又能在酵母细胞中自主复制。 ③穿梭载体（shuttle vector） 在YRp质粒中插入酵母染色体的着丝粒区。 特点： YRp质粒 酵母着丝粒 （3）着丝粒质粒(YCp) ③不易从细胞中提取。 ①行为像染色体，能稳定遗传。 ②单拷贝存在。 由大肠杆菌质粒、2?