云南红豆杉细胞培养和紫杉醇生产.docVIP

 第 23 卷第 4 期 2001 年 12 月 湖北大学学报 (自然科学版) Vol . 23 No . 4 Journal of Hubei University(Natural Science Edition) Dec . ,2001 文章编号 :1000 - 2375 (2001) 04 - 0366 - 04 云南红豆杉细胞培养和紫杉醇生产 陈永勤1 ,朱蔚华2 ,吴蕴祺2 ,胡 秋2 (1. 湖北大学生命科学学院 ,湖北 武汉 430062 ; 中国医学科学院 ,中国协和医科大学 药物研究所 ,北京 100050) 摘 要 :研究了在固体和液体培养条件下云南红豆杉 ( Taxus y unnanensis ) 细胞系 TY6 生长和紫杉醇积累 的动态及培养基中无机氮源形式对其生长的紫杉醇形成的影响. 结果表明 ,在固体和液体培养条件下 ,云南红 豆杉细胞的生长和紫杉醇积累动态相似 ,但液体培养时细胞生长周期缩短了 7 d ,紫杉醇含量降低了 1 倍 ; 新 形成的细胞需要经过一段时间生长后才有较高的紫杉醇合成能力 ; 培养基中硝态氮浓度高有利于细胞生长 , 铵态氮浓度高有利于紫杉醇形成 ;在培养第 12 d 时用铵态氮培养基更换硝态氮培养基可使悬浮细胞的紫杉 醇产量达到 8. 5 mg·L - 1 ,比对照高 1. 6 倍 . 关键词 :云南红豆杉 ;细胞培养 ;紫杉醇 ;无机氮 中图分类号 :Q813. 1 文献标识码 :A 从红豆杉属植物中分离出来的紫杉醇 ( Taxol) 已成为临床上治疗乳腺癌和卵巢癌的重要药物1 . 由 于受红豆杉属植物资源的限制 ,人们一直试图利用化学合成方法和植物细胞工程技术来解决紫杉醇药 源短缺的问题 ,但均未达到商业应用水平 . 在红豆杉属植物细胞工程研究方面 ,人们已对多种红豆杉进 行了细胞培养 ,并在细胞培养技术和提高紫杉醇含量等方面取得了一些进展1 . Fett - Neto 等2 和 Srini2 vasan 等3 还分别研究了培养周期中东北红豆杉细胞和欧洲红豆杉细胞的生长和紫杉醇积累动态. 罗建 平等4 曾报道了云南红豆杉愈伤组织的生长动态 ,但没有报道紫杉醇含量的变化. 我们在进行云南红豆 杉组织培养时 ,选到了一个紫杉醇含量较高的细胞系 ( TY6) ,并研究了它在固体培养和液体培养时的生 长和紫杉醇积累动态及培养基中无机氮源形式对其生长和紫杉醇生产的影响. 1 材料与方法 1. 1 细胞系的建立 云南红豆杉 ( Tax us y unnanensis Cheng et L . K. Fu) 愈伤组织的诱导和继代培养方 法同前5 . 悬浮细胞培养是通过将愈伤组织接种在液体增殖培养基中 、在摇床上震荡培养建立起来的 ,第一代 为 7 d ,第二代和第三代为 10 d ,以后每 15 d 继代 1 次 . 培养基和培养条件同前6 . 1. 2 愈伤组织和悬浮细胞生长和紫杉醇积累动态 将继代 20 d 的愈伤组织接种在增殖培养基上 ,每隔 5 d 随机取 6 瓶 ,记录鲜重 ;烘干后再称其干重 ,并分析紫杉醇含量. 悬浮细胞培养时 ,为了使各瓶的细胞均匀一致 ,先让各瓶细胞培养物静置片刻 ,倒出上层培养液 ,再 将剩下的细胞培养物倒入装有新鲜增殖培养基的 2 000 mL 三角瓶中. 摇匀后 ,分装到 250 mL 三角瓶中 , 每瓶 80 mL ,接种量为 7 . 09 ±0 . 15 g·L - 1 干细胞. 接种后每 3 d 取样一次 ,每次随机取 3 瓶 . 细胞离心收 集 ,烘干后用于细胞干重和紫杉醇含量的测定. 无细胞的培养液用于紫杉醇和糖浓度测定. 1 . 3 NO - 和 NH+ 对愈伤组织和悬浮细胞生长和紫杉醇含量的影响 在愈伤组织试验中 ,设 4 种 NO - 3 4 3 和 NH + 浓度不同的处理组合 (表 2) . 用 KNO 和 HN Cl 调节各处理的 NO - 和 NH + 浓度 ,用 KCl 平衡其 4 3 4 3 4 收稿日期 :2000 - 11 - 24 基金项目 :湖北省教育厅科研基金 (98B004) 作者简介 :陈永勤 (1961 - ) ,男 ,博士 ,副教授 K+ 浓度. NH Cl 为过滤灭菌 ,其它成分为高温灭菌. 培养 30 d. 4 悬浮细胞培养方法同 1 . 2 ,但培养容器为 500 mL 三角瓶 ,每瓶 130 mL . 培养至第 12 d 时 ,将 3 瓶的培 养基倒尽 ,倒入无机氮全为 NH + 的新鲜增殖培养基 ,每瓶培养物最终体积与对照大致相同 . 试验至第 4 19 d 结束. 细胞离心