特异性抗体的制备@.pptVIP

第一节 免疫原的制备 一、颗粒(细胞)性抗原制备 二、可溶性免疫原制备 三、人工抗原的制备 四、佐剂 组织和细胞成分混合抗原制备程序 常用酶类：溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等 方法：在一定的条件下，能消化细菌和 组织细胞 特点：①此法适用多种微生物； ②具有作用条件温和； 　　　 ③内含物成分不易受到破坏； ④细胞壁损坏的程度可以控制。 2.超声破碎法 原理：利用超声波的机械振动而使细胞破碎。 由于超声波发生的空化作用（cavitation）使得液 体形成局部减压引起液体内部发生流动，漩涡生成 与消失时，产生很大的压力，使细胞破碎。超声波 所使用的频率从1kHz～20kHz不等，间歇进行，避 免长期超声产热，导致抗原破坏。 特点：①操作简单，重复性较好，节省时间； ②多用于微生物和组织细胞的破碎。 亲和层析法示意图 氧化法和还原法评价 1.氧化法：优点是切开后，肽链不能重新形 成二硫键、便于肽链纯化；缺点是色氨酸 侧链容易被破坏。 2.还原法：将二硫键还原成巯基。但极不稳 定，易重新形成二硫键，必须及时用碘乙 酸或碘化酰胺进行羧甲基化。 三、人工抗原的制备 人工抗原：是指经过人工修饰后具有免疫原性的半抗原。如：低分子量的化学物质。例如多糖、多肽、甾族激素、脂肪胺、类脂质、核苷、某些药物(包括抗生素）及其他化学物品等。 (一)载体的选择  1.蛋白质：人血清白蛋白、牛血清白蛋白、兔 血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白等。 2.多肽聚合物：人工合成的，常见的有多聚赖 氨酸，其分子量大（可达十几万到几十万)，这种多聚物和半抗原结合后，可刺激免疫动物产生高效价、高亲和力的抗体。 3.大聚合物：羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮 等，可与半抗原结合，加入弗氏完全佐剂亦 可诱发动物产生抗体。 (三) 人工抗原的鉴定 至少20个以上的半抗原分子连接到一个载体分子上，才能有效地产生抗体。 第二节 免疫血清的制备 四、免疫血清的纯化 (一) 特异性抗体的纯化 1.亲合层析法：将交叉抗原交联到Sepharose 4B上，装柱，将预吸收抗体通过亲合层析柱，杂抗体吸在柱上，流出液是特异性抗体。 2.吸附法：利用不含特异性抗原的抗原液，直 接加到免疫血清中，抗原则与抗体结合，上 清液则为无杂抗体的单价特异性抗体。 (二) IgG类抗体的纯化 1.盐吸沉淀法：经硫酸铵盐吸提取γ球蛋白 3次，基本为IgG类抗体，但不纯。 2.离子交换层析法：DEAE纤维素或QAE纤维素。 3.亲和层析法：将抗原交联Sepharose 4B制成亲和层析柱(抗血清、过柱、洗脱、改变洗脱液酸硷度、IgG从层析柱解离、收集)。 五、抗血清的鉴定与保存 第三节 单克隆抗体制备 1.氢氧化铝佐剂： 5%硫酸铝 5%氢氧化钠 氢氧化铝沉淀 制成悬液 即为佐剂 强烈搅拌 NS洗 二次 NS 等体积抗原 免疫接种 10%硫酸钾铝 氢氧化钠校正pH值至6.5 沉淀 乳状悬液 * 明矾佐剂抗原常用用于肌肉注射，皮下注射 易引起肉芽种和脓肿。 NS搅拌 NS洗 二次 离心 抗原 备用 防腐剂 作用大于不完全佐剂 局部形成肉芽种和溃疡 不能用于人体 弗氏完全佐剂 3.弗氏佐剂(Freund adjuvant) 液体石蜡 完全乳化 备用 ＋ 高压 灭菌 加热 抗原 弗氏不完全佐剂 卡介苗 羊毛脂 鉴定 一滴 乳剂 乳剂不散浮于液面 水中 混合 目的:①增强抗原对机体的免疫原性； ②增强抗体的产生能力； ③为制备出高效价的免疫血清； ④增强可溶性抗原的免疫原性； ⑤在某种情况下，要改变抗原免疫应答类型； ⑥延长抗原在免疫动物的时间； ⑦改变抗原的分布； ⑧增强局部对变应原的超敏反情况； ①佐剂常混有微量其它物质，这些物质进 入体内后也可引起抗体的产主，影响抗 血清的特异性； ②注射佐剂可引起局部形成肉芽肿和无菌 性脓肿； ③反复注射，易发生超敏反应，使局部组 织坏死，甚至引起动物死亡。 返回 一.选择免疫动物 二.免疫方法 三.动物采血法 四.免疫血清的纯化 五.抗血清的鉴定与保存 能作为免疫接种用的动物主要是哺乳类和禽类。 兔、绵羊、豚鼠、鸡、山羊和马。 (一).抗原与动物种属关系：差异越远越好； (二).