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分子生物学技术综合实验讲义 上海交通大学生命科学技术学院 2004年11月 说 明 本实验讲义是在接受了去年实验的成功经验和失败的教训的基础上编写的。实验的名字叫“分子生物学技术综合实验”，原来是想把它设计成一个彼此连贯、前后呼应的系列实验。但由于经费和条件的限制，还是放弃了这个念头。 实验分成两个部分：前一部分是DNA的操作，主要是DNA片段的亚克隆的方法；后一部分是蛋白的操作，主要是凝胶电泳和免疫杂交。两个部分的分量大致相当，但后一部分做起来对学生的收获可能更大些，因为很少有本科生能一个人原原本本地亲手做一做免疫印迹实验的。它的操作虽然并不复杂，但成本却很高，特别如果使用的是从公司购买的抗体的话。 实验讲义在文字上，主要参考了魏群主编的《分子生物学实验指导》，而在实质内容上，DNA操作部分更多的是参考了萨姆布鲁克等人的《基因克隆》第二版的中译本，蛋白质部分主要是根据自己平日工作的积累。 希望同学们能够珍惜这次机会，认真地做实验，真正地掌握些实实在在的实验操作技能，为今后的学习和工作打下基础。千万不要忽视实验技能的培养和提高，生物学的成就毕竟主要是通过实验干出来的。 上海交大生命学院 孙群 2004年11月 实验一 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 [实验原理]（供参考，试剂盒的Solution SS成分未知） 细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。其原理是：在0℃下的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形。转化缓冲液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羟基—钙磷酸复合物，此复合物粘附于细菌细胞表面。42℃短时间热处理（热休克），可以促进细胞吸收DNA复合物。将处理后的细菌放置在非选择性培养液中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型(如Amp抗性) 得到表达。然后再涂布于含有氨苄青霉素的选择性平板上，37℃培养过夜，这样即可得到转化菌落。 [仪器、材料与试剂] (一)仪器 1．小型高速离心机 2．恒温摇床 3．恒温箱 4．-20℃冰箱 5．恒温水浴器 (二)材料 1．氨苄青霉素 2．大肠杆菌DH5( 3．pUC19 4．1.5mL 离心管 5．枪头、枪 6．试管、培养皿 (三)试剂 1．快速感受态细菌制备试剂盒（申能博彩公司产品） 2．LB培养液 在950mL去离子水中加入： 胰蛋白胨 (tryptone) 10g 酵母提取物 (yeast extract) 5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质完全溶解，用Na0H调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1L，121℃湿热灭菌20min。 3．氨苄青霉素(Amp)，用无菌水配制成100mg／mL 溶液，置-20℃冰箱保存。 [实验步骤] 1．从大肠杆菌DH5(平板上挑取一个单菌落接于2mL LB培养液的试管中，37℃振荡培养过夜。 2．取50(L菌液转接到一个含有5mL LB培养液锥形瓶中，37℃振荡培养2小时。 以下步骤按修改后的试剂盒说明书进行。 3．用灭菌的枪头取0.5mL的大肠杆菌培养物于1.5mL灭菌离心管中，冰上放置3分钟后，加入0.5mL预冷的Solution SS。在冰上小心地用1mL 枪头将细胞悬浮起来。注意：1mL的取液器设定在500(L。悬浮细胞要轻，防止细胞进入枪内。 4．将上述细胞分装于1.5mL离心管 (离心管要在放在冰上预冷) 中，每管0.1mL。细胞可以立即使用或储存。 5．将感受态细胞迅速转移到-20℃或更低的低温冰中。注意：在转移过程中要防止温度升高，解决的办法之一是在塑料袋里装上低温冰块，将细胞迅速转移到塑料里，将整个塑料袋放到低温冰箱内。 转化： 1．新鲜制备的或-20℃下保存的100(L感受态细胞，置于冰上，完全解冰后轻轻地将细胞均匀悬浮。 2．加入5(L pUC19质粒，DNA浓度为10pg/(L，轻轻混匀。 3．冰上放置30分钟。 4．42℃水浴热激60秒。 5．冰上放置2分钟。 6．加400(L LB培养液，37℃ 250转／分振荡培养30分钟。 7．室温下4000rpm离心5分钟，用枪头吸掉400(L上清液，用剩余的培养液将细胞悬浮。 8．将细菌涂布在 Amp/LB琼脂平板上。 9．平皿在37℃下正向放置1小时，待接种的液体吸收进琼脂后，将平皿倒置，培养过夜。 [实验结果] 经37℃培养过夜的、在氨苄青霉素/LB琼脂平板上出现