m第十四章 基因工程.ppt

临床医学院生物化学教研室 佘集凯; 基因重组和基因工程 ;第 一 节DNA的重组 DNA Recombination;DNA重组;发生在同源序列间的重组称为同源重组，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。 ; 内切酶 (recBCD);片段重组体 ： 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。;Holiday中间体;二、细菌的基因转移与重组;（一）接合作用;可接合质粒如 F 因子(F factor) ;（二）转化作用;例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。;;（三）转导作用;λ噬菌体的生活史;;;;例（二）细菌的特异位点重组;hix为反向重复序列，它们之间的H片段可在Hin控制下进行特异位点重组(倒位)。H片段上有两个启动子P，其一驱动hin基因表达，另一正向时驱动H2和rH1基因表达，反向(倒位)时H2和rH1不表达。rH1为H1的阻遏蛋白基因。; H2鞭毛素;例（三）免疫球蛋白基因的重排;重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基因的V-J重排均发生在特异位点上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的两侧均存在保守的重组信号序列(recombination signal sequence, RSS)。此重排的重组酶基因rag (recombination activating gene)共有两个，分别产生蛋白质RAG1和RAG2。 ;V片段;四、转座重组;典型的插入序列(IS)组成： 二个分离的反向重复(IR)序列 一个转座酶（transposase)编码基因 特有的正向重复序列 ;插入序列的复制性转座;转座子(transposons) ——可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。 转座子组成：反向重复序列 转座酶编码基因 抗生素抗性等有用的基因;;由转座子介导的转座;第 二 节 重组DNA技术;重组DNA技术的发展史;相关概念 DNA克隆 工具酶 目的基因 基因载体 基本原理 重组DNA技术与医学的关系;一、重组DNA技术相关概念 ;技术水平：分子克隆 即DNA 克隆 细胞克隆 个体克隆（动物或植物）　;DNA克隆 应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子。 也称基因克隆或重组DNA 。 ;生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等;（二）工具酶;重组DNA技术中常用的工具酶;限制性核酸内切酶;作用 与甲基化酶共同构成细菌的限制-修饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。;第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。;Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome) ;Bam HⅠ;同功异源酶 来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。;同尾酶 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端。;（三）目的基因;（四）基因载体;克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。;载体的选择标准;1. 质粒 (plasmid);;λ噬菌体DNA改造系统 λgt系列（插入型，适用cDNA克隆） EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）;M13噬菌体pUC系列的物理图谱;3. 粘性质粒(cosmid);酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）;二、重组DNA技术基本原理; 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程;（一）目的基因的获取;* 1、化学合成法获取目的基因;组织或细胞染色体DNA;限制酶切位点;mRNA ;（二）克隆载体的选择和构建;（三）外源基因与载体的连接;B