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第五讲 基因芯片检测技术 简介 当荧光染料被激发光激发后，便会产生荧光光子，荧光的强弱代表了荧光化合物的含量，因此可以用光探测器对产生的荧光进行定量检测，以确定荧光化合物的含量，从而计算出DNA或RNA的含量。 生物芯片的扫描是指将与目标DNA（或RNA）杂交后、或与目标抗原、抗体、或受体等目标靶分子反应结合后的生物芯片上成千上万个点阵的生物反应结果阅读出来，转变成为可供计算机处理的数据。 简介 根据生物芯片所使用的标记物不同，相应的信号检测方法有放射性同位素法、生物素标记法、荧光染料标记法等。 目前基因芯片最普遍采用的标记和检测法是荧光法，相应的检测装置主要有激光共聚焦显微镜、CCD相机、激光扫描荧光显微镜、激光共聚焦扫描仪等。 基因芯片检测系统可以分为硬件系统和软件系统两个部分，由于常用的基因芯片检测系统采用扫描的方式得到图像，因此又称为基因芯片扫描仪。 扫描仪 基因芯片检测仪 芯片检测体系的硬件部分主要包括：照明光源、光路系统、光探测器、机械部分和A/D转换器等。 照明光源 当荧光化合物或者染料受到特定波长的激发光激发后，会吸收激发光子，然后发射荧光光子。 选择光源（荧光染料激发光的光源）遵循两个原则：一是为了提高检测的灵敏度，需要选择高强度的激发光源，以激发较多的荧光光子，二是激发光的波长范围要避免将其所激发的荧光波长覆盖。 荧光染料与荧光光谱 各种荧光化合物有各自特定的最大激发光吸收波长和最大发射波长。两峰值波长差值称为斯托克斯位移(Stokes shift)。斯托克斯位移太小，激发光和发射荧光的光谱有较大部分重叠，影响对荧光强度的测量精度。实际中，选取斯托克斯位移较大的荧光材料。 Cy3 550-570nm 20nm Cy5 649-670nm 21nm 荧光强度在一定范围内与激发光的强度成正比。 荧光分子受到激发后，以球状方式发射荧光光子 激光光源 单色性好、方向性好、能量集中、亮度高、相干性好、能产生强度较高的发射荧光，可以大大地提高检测灵敏度 为了同时检测多种荧光，在具体实现过程中，光源系统都设计成多波长结构，通常采用多个激光器。 气体激光器，比如氦氖激光器，输出连续光，输出光束质量很好，单色性好，稳定性高，输出光为可见光。 半导体激光器，波长范围广。体积小，质量轻，价格便宜。 非激光光源 非激光光源，波长范围比较宽。 为了避免激发光对荧光的干扰，通常需要加装滤光片来选择与荧光最大激发波长相吻合的光。 要检测多种荧光，采用多个滤光片来选择多种特定的波长 低氩汞灯和短弧氙灯。 照明方式 照明区域是线和面，可以同时激发大面积的荧光，实现光强的均匀性，主要是非激光光源。 激光高相干性，在较大面积上光强很难一致。一般激光光源为点照明方式，为了实现大面积成像，必须通过扫描来实现。 光路系统 光收集：荧光收集多采用光学透镜系统，透镜收集光的立体角的大小直接影响系统的效率 。透镜收集光的效率以数码孔径（NA）表示。NA为1.0，表明透镜收集了整个半球面的光，相对应的光收集效率为50％。多数共聚焦激光微阵列扫描仪物镜的NA为0.5～0.9，而绝大多数CCD阵列扫描仪的NA为0.2～0.5。 激发/发射光的识别和分离：由于荧光发射强度要远远小于激发光强度，因此要从激发光中检测出微弱的荧光信号，就需要对这两种类型的光进行分离。 激发/发射光的识别和分离 几何分离：根据激发光和荧光光路的几何关系进行分离。一种方式用一个很小的反光镜将激发光束反射，而让环形部分的荧光光束通过；另一种方式是激发光束和系统光路不同轴，在成像过程中，激发光束所成的像和荧光光束所成的像会发生分离，从而过滤掉激发光束。但由于光学系统各种表面的反射和散射，会使部分激发光混入检测系统中，通常的解决办法是在探测器前放滤光片对荧光进行过滤。 波长分离：根据激发光和荧光的波长差异进行分离。根据激发光波长和荧光波长不完全重合的事实，用滤光片将其分离。 激发光的入射角度 芯片不平整，芯片表面的灰尘，片基不均匀，环境中的尘粒都会引起光的强烈散射，产生散射光，另外入射光照在芯片上也产生反射光。但干涉滤光片不能完全滤除散射光与反射光。 检测角度确定时，杂质微粒引起的散射光的强度与入射光角度有关。入射光与检测角成0度时最强，90度时最弱。 但生物芯片扫描仪难以实现与入射光成90度的检测，因为荧光检测必须在芯片的正上方，与芯片垂直，以保证最大的采光量并避免芯片荧光图像的失真。 入射光与检测成0度是激光系统芯片扫描仪常采用的方式。CCD系统芯片扫描仪及部分激光系统扫描仪多采用入射光与检测成45度或135度的方式。 光漂白现象 光漂白是指荧光染料分子在激发光的照射下，其产生荧光的强度随着时间的延长逐渐变弱消失的过程。 几乎所有的荧光染料都存在这种光漂白现象, 光漂白的程