松生拟层孔菌菌丝乙醇提取物体内外抑瘤作用及其机制8.docVIP

松生拟层孔菌子实体乙醇提取物乙酸乙酯相体内外抑瘤作用及其机制 肖细林 高劲松* 李增博 胡云南 扈凤平 （长沙医学院，长沙，410219） 【摘要】 目的：观察松生拟层孔菌子实体乙醇提取物乙酸乙酯相（以下简称提取物）体内外抗肿瘤活性及对免疫器官的影响，并探讨其抑瘤机制。方法：体外药效试验用MTT法，观察提取物对小鼠肝癌细胞株H22及小鼠肉瘤细胞株S180的增殖作用的影响；体内用小鼠移植性肿瘤，采用荷瘤小鼠瘤重、抑瘤率检测提取物对小鼠肝癌细胞H22及小鼠肉瘤细胞S180的抑制作用。通过检测胸腺指数，脾脏指数及小鼠外周血白细胞计数等指标观察提取物对免疫器官及红细胞免疫功能的影响。通过观察各个器官（包括肝脏、脾脏、胸腺等）的病理切片，观察提取物对小鼠肉瘤细胞S180细胞的凋亡的影响，并与已知一线抗肿瘤药物环磷酰胺(cy)作对比。结果：1、提取物体外对小鼠肝癌细胞H22及小鼠肉瘤细胞S180的增殖有显著的抑制作用，抑制率分别高达82.40%，74.01%；2、提取物体内对荷瘤小鼠小鼠肉瘤细胞株S180肿瘤也有显著的抑制作用，其低、中、高剂量组肿瘤抑制率分别为79.92%、66.18%、78.45%；3、用药组脾脏指数、胸腺指数及白细胞计数增加。结论：1、提取物具有一定的体内外抗肿瘤活性。2、提取物有免疫增强作用。3、提取物对机体各免疫器官的毒副作用小于已知一线抗肿瘤药物环磷酰胺(cy)对机体各免疫器官的毒副作用。 关键词：松生拟层孔菌子实体乙醇提取物乙酸乙酯相；MTT法；H22细胞;S180细胞;小鼠移植性肿瘤 松生拟层孔菌（Formitopsis pinicola）,别名红缘孔菌，属多孔类真菌中的一种，为我国已知60多余种药用多孔菌之一，我国大部分省（区）均有分布。具有祛风除湿之功效。主要用于风寒湿痹，关节疼痛等症的治疗。国内已有其乙醇提取物乙酸乙酯相对Hela细胞，小鼠肝癌细胞株及人肺癌细胞的增殖均有一定的抑制作用的报道。本文通过建立松生拟层孔菌子实体乙醇提取物乙酸乙酯相技术和小鼠肉瘤细胞移植瘤实验模型，研究松生拟层孔菌子实体乙醇提取物乙酸乙酯相体内抗肿瘤活性及其抑瘤机制;以及体外对H22细胞系及S180细胞系的增殖抑制作用。 1、材料与方法 1、1材料 1、1、1试验药物：松生拟层孔菌子实体乙醇提取物乙酸乙酯相是由长白山林区采集的松生拟层孔菌干燥子实体2.9kg 经粉碎后，用95% 乙醇加热回流提取3次，每次2h，提取液经减压旋蒸，除去溶剂，浓缩后得棕褐色浸膏0.4Kg。将浸膏与100-200目硅胶按1:2拌匀后，分别用石油醚、乙酸乙酯和甲醇淋洗，得石油醚相约95g，乙酸乙酯相270g，甲醇相约16g。细胞培养给药临用前配制：根据已有实验结果取其乙醇提取物乙酸乙酯相相充分研磨后，用少量95%的乙醇溶解后加少量吐温80再用0.9%的生理盐水稀释成一定浓度后，再用RPMI1640培养基稀释成各所需浓度。动物给药配制：取其乙醇提取物乙酸乙酯相充分研磨后，用少量95%的乙醇溶解后加少量吐温80再用0.9%的生理盐水稀释成一定浓度后，再用生理盐水稀释成各所需浓度。;环磷酰胺(cy)（山西普德药业有限公司，批 1、1、4、仪器：旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司），96孔细胞培养板购于Gibico 公司， WJ-2型CO2细胞培养箱（上海跃进医疗器械有限公司）、ST-360型酶标仪（上海智华医学精密仪器有限公司）、倒置显微镜、普通光学显微镜、超净工作台、高压灭菌锅 1、2、方法 1、2、1、1松生拟层孔菌子实体提取物体外对S180抑制作用：S180细胞生长于含体积分数为10%的灭活小牛血清和青霉素1105u/l、链霉素100g/l,在37℃,5%CO2饱和湿度细胞培养箱内培养，取对数生长期的S180细胞，用MTT法，以台盼蓝染色，要求活细胞数大于95%以上，以104/孔的活细胞接种于96孔细胞培养板（200ul/孔）中，加入培养基及药物,配成每组终浓度分别为50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml、400ug/ml并设培养液对照组。继续培养48—72小时后，加5mg/mlMTT试剂20ul/孔，孵育4h后弃上清液，加DMSO 150ul/孔，轻度振荡溶解，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度A值，计算细胞生长的抑制率。实验重复3次。所得结果用以下公式计算 细胞生长抑制率=（1-给药组吸光度A值/对照组吸光度A值）100% 1、2、1、2松生拟层孔菌子实体乙醇提取物乙酸乙酯相体外对H22抑制作用：方法同上1、2、1、1 1、2、2松生拟层孔菌子实体乙醇提取物乙酸乙酯相对体内小鼠移植瘤的抑制作用的观察 1、2、2、1松生拟层孔菌子实体乙醇提取物乙酸乙酯相对小鼠