活性内生真菌ezg0807的鉴定及其生物学特性研究-生物通.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３３（１０）：５１５８ 活性内生真菌ＥＺＧ０８０７的鉴定及其生物学特性研究 严菊芬　齐宁波　王素萍　盖丽丽　杨树林 （南京理工大学环境与生物工程学院　南京　２１００９４） 摘要　从传统中药温莪术根部分离出一株活性内生真菌ＥＺＧ０８０７，采用分子生物学与形态学观 察相结合的方法对其进行鉴定。通过ＰＣＲ扩增该菌ＩＴＳ区域并在ＮＣＢＩ中进行同源性分析，构建 系统发育树，结合形态学观察，鉴定其为串珠赤霉菌Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ，是一种兼性内生真菌， 既是植物和昆虫病害的病原体，又能作为内生真菌促进宿主植物的生长；为了更好地了解和利用 活性菌株 ＥＺＧ０８０７，对其进行了生物学特性及发酵条件优化的研究。该菌除对半乳糖和 （ＮＨ）ＳＯ利用度较差外，能利用多种常见的培养基；其生长温度范围为１５～３５℃，最适生长温 ４ ２ ４ 度为３０℃；菌株生长ｐＨ范围为４．０～１０．０，最适ｐＨ为７。根据菌株ＥＺＧ０８０７的生长特性及前期 单因素实验结果，经响应面优化后的发酵条件为发酵温度２８．７２℃，初始ｐＨ值６．７６，发酵时间 １０．０２ｄ，测得其发酵液对普通变形杆菌的抑菌圈直径为２５．６ｍｍ，比优化前提高２４．９％。熟悉该 菌株的生长培养条件和营养需求，可为后续研究其代谢产物奠定基础。 关键词　内生真菌　ＩＴＳ　赤霉属　鉴定 中图分类号　Ｑ９３３３１　Ｑ８１９ ［１］ 　　传统的真菌分类鉴定主要是按照真菌的形态、生 等 首先设计ＩＴＳ引物对真菌核内核糖体ＲＮＡ基因进 长以及生理生化等特征对真菌进行分类。然而真菌的 行扩增以来，ＩＴＳ序列分析技术在真菌分类、鉴定研究 ［２５］ 种类繁多，个体多态性明显，而且其生长、生理生化特 中应用得越来越广泛 。 征也会随着环境的变化而不稳定。因此，仅采用传统 　　前期从传统中药温莪术植物中筛选出４９株内生 的方法对真菌进行正确的分类存在较大的困难。随着 真菌，经过初筛复筛后得到１株活性菌株ＥＺＧ０８０７，具 分子生物学技术的发展，核酸序列分析已广泛地应用 有较广的抗菌抗肿瘤活性。为了更好研究开发利用此 于真菌分类鉴定中。 活性菌株，本文利用ＩＴＳ序列分析技术，辅助形态学观 　　真核生物基因组中编码核糖体的基因包括 ２８Ｓ 察，对其进行分类鉴定，确定其种属地位；并通过对其 ｒＤＮＡ、５ＳｒＤＮＡ、１８ＳｒＤＮＡ和５．８ＳｒＤＮＡ４种，它们在 生物学特性的研究，为后续代谢产物的研究打下基础。 染色体上头尾相连、串联，相互之间由间隔区分隔。其 中１８Ｓ、５．８Ｓ和２８ＳｒＤＮＡ基因组成一个转录单元（图 １）。ｒＤＮＡ在种内由于基因的流动而经常表现出很高 的同源性，在种间则保持着各种程度的变异，变异的多 图１　ＩＴＳ区段ＰＣＲ扩增引物示意图 Ｆｉｇ．１　ＴｈｅｄｉａｇｒａｍｍａｔｉｃｓｋｅｔｃｈｏｆＰＣＲ 少能够反映生物进化上属内种间亲缘关系的远近；与 ｐｒｉｍｅｒｓｆｏｒａｍｐｌｉｆｙｉｎｇＩＴＳ ｒＤＮＡ中的１８Ｓ、５．８Ｓ和２８Ｓ的基因组序列相比较，ＩＴＳ１ 和ＩＴＳ２作为非编码区，承受的进化选择压力较小，相对 变化较大，在种间表现出较高的差异，可以为研究真菌 １　材料与方法 的分类鉴定提供丰富的遗传信息。自１９９０年 Ｗｈｉｔｅ １．１　材　料 收稿日期：２０１３０７１５　　修回日期：２０１３０８１６ １．１．１　菌株　一株分离自温莪术根部的活性内生真 通讯作者，电子信箱：ｙｓｈｕｌｉｎ＠ｍａｉｌ．ｎｊｕ