前列腺素脱氢酶在大肠杆菌中的表达纯化及鉴定-生物通.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（５）：４１～４５ 前列腺素脱氢酶在大肠杆菌中的表达纯化及鉴定 １ １ １ １ ２ １ 李美宁 　解　军 　常冰梅 　张悦红 　殷云勤 　程牛亮 （１山西医科大学生物化学与分子生物学教研室　太原　０３０００１） （２山西医科大学第一医院消化检验中心　太原　０３０００１） 摘要　１５羟基前列腺素脱氢酶（ＰＧＤＨ）属于抑癌基因，在多种肿瘤中表达缺失，在肿瘤的发生发 ? 展中起着重要作用。提取人正常大肠黏膜组织总ＲＮＡ，利用ＲＴＰＣＲ方法扩增得到ＰＧＤＨ基因的 ? 编码序列，克隆入原核表达载体ｐＢＶ２２０，测序鉴定正确后转化Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５，经温控诱导表达，表 α 达产物进行ＳＤＳＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ，证实为相对分子质量约为２９０００的ＰＧＤＨＨｉｓ６蛋白，表达 ? ? ２＋ 产物以包涵体形式存在，３ｈ诱导表达量最高，约占菌体总蛋白的３０％。经Ｎｉ 配体亲和层析纯 化得到纯度大于９５％的目的蛋白。重组ＰＧＤＨ简单复性后具有一定的生物活性，约为３．７× ４ １０Ｕ／ｍｇ，为下一步研究其在肿瘤中的作用奠定了基础。 关键词　大肠癌　１５羟基前列腺素脱氢酶　克隆　原核表达 ? 中图分类号　Ｑ７８６ ＋ ＋ 　　ＮＡＤ 依赖的１５羟基前列腺素脱氢酶（ＮＡＤ 实验室保存；Ｔｒｉｚｏｌ购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；反转录试剂盒、 ? ? ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ１５ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＰＧＤＨ）是 ? 克隆质粒ｐＭＤ１８Ｔ、限制性内切酶ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ、ＬＡＴａｑ ? 前列腺素（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ，ＰＧｓ）和相关的二十烷类生物活性 酶及胶回收试剂盒均购自ＴａＫａＲａ公司；Ｔｒｉｓ碱、Ｔ４ 物质降解、灭活的关键酶，可催化有活性的１５羟基前列腺 ? ＤＮＡ连接酶、蛋白酶抑制剂和琼脂糖购自Ｐｒｏｍｅｇａ公 素氧化成为活性较弱的１５酮基前列腺素。近来研究显示， ? 司；溶菌酶购自Ｍｅａｒｋ公司；ＨｉｓＴａｇ鼠单克隆抗体购自 ? １５ＰＧＤＨ的表达缺失或减少可能与一些恶性肿瘤，如肠 ? ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵 ［１，２］ 癌、肺癌、乳腺癌、甲状腺癌等的发生、发展密切相关 ， 和ＳＤＳ购自Ｓｉｇｍａ公司；低相对分子质量蛋白标准购自 恢复其表达则对肿瘤的生长、转移有一定的抑制作用，如： 华美公司；胰化蛋白胨和酵母提取物购自Ｏｘｏｉｄ公司； 肺腺癌Ａ５４９细胞转染表达ＰＧＤＨ后裸鼠致瘤能力明显降 ２＋ ３ Ｎ