乙酰乳酸合成酶基因budb整合表达载体的构建-中国农学通报.pdfVIP

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2017-11-04 发布于天津
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乙酰乳酸合成酶基因budb整合表达载体的构建-中国农学通报.pdf

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中国农学通报 2017,33(8):25-30 Chinese Agricultural Science Bulletin 乙酰乳酸合成酶基因(budB)整合表达载体的构建葛菁萍，邓利廷，孙雯，宋刚，平文祥（微生物黑龙江省高校重点实验室，黑龙江大学生命科学学院，哈尔滨150080）摘要：为了进一步了解2,3- 丁二醇合成路径中关键酶的表达量与产量之间的关系，本研究根据 GenBank 中乙酰乳酸合成酶基因(budB) 的基因序列设计引物，以产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca) HD79 基因组DNA 为模板，通过PCR 扩增技术得到目标酶基因，目的片段全长1680 bp 。以表达载体 pRSFDuet- 1 为骨架，利用基因工程手段构建整合表达载体pR 1SW-budB 。电转化法将其转化至菌株 HD79 感受态细胞中，通过高浓度Kan 筛选和PCR 双重鉴定验证后测定ALS 酶活力。结果表明，乙酰乳酸合成酶基因整合表达载体构建成功，酶活可达1.0627 U/mg ，比原始菌株提高了4.35 倍。在一定程度上为实现2,3-丁二醇的工业化生产奠定基础。关键词：2,3-丁二醇；乙酰乳酸合成酶；产酸克雷伯氏菌；电转化法；酶活力中图分类号：Q933 文献标志码：A 论文编号：cas TheConstructionofAcetolactateSynthaseGeneIntegrationExpressionVector GeJingping,DengLiting,SunWen,SongGang,PingWenxiang (KeyLaboratoryofMicrobiology,CollegeofLifeSciences,HeilongjiangUniversity,Harbin150080) Abstract:Tolearnmoreabouttherelationshipbetweenexpressionlevelsandyieldofthekeyenzymesin 2,3- BDsynthesisroute,theprimersweredesignedaccordingtothesequenceofbudBinGenBank.Takinggenomic DNAofKlebsiellaoxytoca HD79 astemplates,thetargetacetolactatesynthasegene(budB)wasobtainedby PCR.Thetargetfragmentwas 1680 bp.ThemulticopyingintegratedexpressionvectorpR1SW-budB was constructedusingexpressionvectorpRSFDuet-1asaframeworkbymeansofgeneticengineering.Theplasmid pR1SW-budB wastransformedinto Klebisellaoxytoca HD79 byelectricconversion,thenscreenedthrough highconcentrationKan,followedbyPCRamplificationbeforedeterminationofenzymeactivity.Theresults demonstratedsuccessfulconstructionoftheintegratedexpressionvectorofacetolactatesynthasegene,with highALSactivityof 1.0627U/mg,whichwas4.35timesoftheoriginalactivity.Thesefindingslayafoundation fortheindustrialproductionof2,3-BDinsomedegree. Keywords:2,3-butanediol;acetolactatesynthase;Klebsiellaoxytoca;electric